Využívání konzervovaného spermatu pro inseminaci se v chovu prasat zvýšilo za posledních 15 let asi trojnásobně. Celosvětově se provádí zhruba 19 miliónů inseminací ročně, z nichž více než 99 % je prováděno se spermatem, které je skladováno ve stavu kapalném po dobu 1 až 5 dnů. V den odběru nebo následující den se provádí téměř 85 % ze všech inseminací.
Rozšíření inseminace je v jednotlivých zemích na různé úrovni, v některých je inseminováno jen 5 % chovaných prasnic, v jiných, především v Evropě, je to skoro 90 % prasnic. Od roku 1975 až do roku 1990 se prudce zvyšovalo používání kapalně uskladněného kančího spermatu zejména v Evropě. Od roku 1990 však růst nastal v Severní a Jižní Americe a pokračuje tam do současnosti. Ve Spojených státech proběhlo podstatné rozšíření prasečí inseminace v posledních pěti letech, pohybující se od 5 % populace prasnic inseminovaných v roce 1993 k odhadovaným 45 až 50 % v letech 1998 až 1999. Tento nárůst používání inseminace je umožněn zlepšenou technologií zpracování spermatu, zvýšenou poptávkou po vyšší kvalitě vepřového masa a tím i zvýšeným profitem z jeho výroby. V neposlední řadě je díky moderním transportním systémům kapalně uskladněné sperma dostupné v den odběru nebo příští, prakticky kdekoli na světě.
Zlepšování postupů inseminace v chovu prasat byly věnované také tři mezinárodní vědecké konference, poskytující informace a podněcující výzkum v oblasti uchovávání kančího spermatu. Tento příspěvek si klade za cíl seznámit čtenáře s některými důležitými postřehy z těchto konferencí, ale i ze světové vědecké literatury (pro detailnější informace lze doporučit například práci Johnsona et al. 2000: Storage of boar semen, Anim. Reprod. Sci, 62, str. 143 až 172). První část bude věnovaná hlavním aspektům, které ovlivňují úspěšnost skladování kančího spermatu v kapalném stavu a druhá část bude zaměřena na problematiku kryokonzervace kančího spermatu.
Úspěšnost inseminace s kančím spermatem skladovaným v kapalném stavu ovlivňují zejména tito činitelé:
Kvalita ejakulovaného spermatu
Teplotní poměry okolního prostředí
Způsob ředění spermatu a složení ředidla
Délka uskladnění spermatu
Počet spermií v inseminační dávce
Načasování inseminace vzhledem k ovulaci
Kvalita spermatu
Oplozovací schopnost spermatu je odhadována na základě kvality (pohyblivost, morfologie, funkční integrita, mikrobiální kontaminace) a kvantity spermií (počet vysoce kvalitních spermií v dávce).
Pohyblivost spermií
Progresivní pohyb spermií je indikátorem neporušeného buněčného metabolizmu a membrán. Odhad pohyblivosti spermií má proto elementární význam v kontrole jakosti spermatu. Kromě toho je podíl pohyblivých spermií důležitý pro stanovení požadovaného stupně ředění s určitým počtem neporušených spermií v inseminační dávce. Jelikož kančí spermie vykazují vyšší procento cyklického pohybu než jiné druhy, je doporučeno odhadovat rozdílné formy pohyblivosti a nejen podíl progresivních spermií, tj. těch, které se pohybují přímočaře (tzv. aktivita spermií). Uskladněné sperma by mělo být hodnoceno každý den a za přijatelný je považován podíl pohyblivých spermií kolem 60 %.
Morfologie spermií
Nejběžnější morfologickou změnou kančích spermií je výskyt cytoplazmatické kapky, což je pravděpodobně primární defekt, mající původ ve varleti, a je důležitý zejména při dlouhodobém uskladnění spermatu, jelikož snižuje rezistenci spermií na in vitro stárnutí. Doporučuje se, aby celkový podíl cytoplazmatických kapek v ejakulátech používaných pro inseminaci nepřesáhl 15 %. To potvrzují i nalezené negativní korelace mezi procentem spermií s cytoplazmatickou kapkou a mírou prasení a počtem narozených selat. Uvádí se, že celkový výskyt morfologicky abnormálních spermií ve spermatu určeného pro inseminaci by neměl přesáhnout 20 %.
Teplota okolního prostředí
Je známo, že kančí spermie jsou velmi citlivé na tzv. teplotní šok. Ten nastává, pokud jsou čerstvě ejakulované kančí spermie prudce ochlazeny z tělesné teploty na teplotu pod 15 °C a projevuje se poklesem životaschopnosti vysokého počtu spermií. Teplotnímu šoku lze zabránit před-ředěním spermatu a jeho uchováním při teplotě kolem 15 °C po několik hodin, čímž spermie dosáhnou postupně rezistence k teplotnímu šoku.
Proč jsou kančí spermie tak vnímavé na prudký pokles okolní teploty bezprostředně po ejakulaci a co způsobuje jejich vyšší odolnost v průběhu inkubace, není přesně známo. Předpokládá se, že teplotní šok může souviset se skladbou lipidů cytoplazmatické membrány, která ovlivňuje její pružnost. Když se teplota snižuje, může docházet k omezení pohybu membránových fosfolipidů a to má za následek přechod od kapalného ke gelovému stavu. Tomuto nasvědčuje i to, že při porovnání býčích spermií, které jsou poměrně odolné vůči teplotnímu šoku, s kančími spermiemi, byla zjištěna rozdílná skladba mastných kyselin fosfolipidů v membránách a tím tedy i rozdílné typy fosfolipidů. Skladba mastných kyselin fosfolipidů určuje jejich funkci. Další faktor, který ovlivňuje tepelnou funkci membrán, je zastoupení cholesterolu. U kančích spermií je poměr mezi cholesterolem a fosfolipidy velmi nízký a cholesterol je rozdělen nesouměrně, více ve vnější než vnitřní vrstvě membrány. To může být příčinou, že vnitřní jednoduchá vrstva membrány je obzvláště citlivá na teplotní šok. Chladem indukovaná reorganizace skladby membrán ovlivňuje jejich funkci zejména zvýšením propustnosti (pronikání kladných iontů a enzymů) a snížením enzymové aktivity. Důležité z praktického hlediska je, že vnímavost kančích spermií na teplotní šok lze eliminovat časem a teplotou.
Ředění spermatu
Přirozeným ředidlem pro spermie je semenná plasma z přídatných pohlavních žláz. Jelikož u některých druhů savců byly provedeny zdárné pokusy s inseminací epididymálních spermií, tzn. že spermie nebyly vystaveny kontaktu se semennou plasmou, mohlo by se jevit, že semenná plasma z přídatných žláz má druhořadý význam. Ale opak je pravdou. Není pochyb o tom, že semenná plasma má důležité regulační funkce, které jsou založené jednak na přímé interakci mezi semennou plasmou a spermiemi a týkají se výživy, ochrany, regulace pohyblivosti, kapacitace, rozpoznání gamet a připojení. Nepřímé funkce spočívají v působení na samičí genitální trakt, semenná plasma zvyšuje děložních kontrakce, napomáhá uvolňování vejcovodové úžiny a reguluje imunitní odezvy v děloze. Společně se tyto funkce semenné plasmy podílí na ochraně, dozrávání a transportu spermií v samičím genitálním traktu a účastní se připojení spermie k zóně pellucida. Blahodárný vliv semenné plasmy při procesu oplodnění byl také zaznamenán v pokusech s předinseminováním semenné plasmy před použitím vlastního spermatu, ve kterých bylo pozorováno zvýšení procenta embryí z 85 % na 96 % a zvýšení počtu připojených spermií z 8 na 75 na zónu pellucida. Tento jev je vysvětlován zlepšeným transportem spermií do místa oplodnění.
Ředění spermatu proto představuje zásah do přirozeného prostředí pro spermie, jelikož se naředí i původní fyziologické komponenty semenné plasmy. Z těchto důvodů se doporučuje, aby poměr ředění nebyl vyšší, než 1 : 10. Takováto koncentrace semenné plasmy je dostačující k ochraně, dozrávání a transportu spermií.
Ředicí efekt
Hlavním účelem ředění je snížit metabolickou aktivitu spermií pomocí chemických inhibitorů a snížením teploty. Bylo pozorováno, že savčí spermie reagují na ředění iniciativním zvýšením aktivity, která postupně vede k poklesu jejich pohyblivosti a k výskytu poškození cytoplazmatických membrán. Zvláště enormní ředění, zejména pokud se použijí pouze čistá elektrolytická média, značně snižuje životaschopnost buněk. Vysvětlení tohoto jevu, který se označuje jako tzv. ředicí efekt, jsou předmětem intenzivního výzkumu. Jedním z nich je, že ředění vede k poklesu vnitrobuněčných komponent a/nebo zředění ochranných agens v semenné plasmě, což způsobuje poškození buněk. Negativní vliv snížení koncentrace důležitých komponent semenné plasmy lze eliminovat například doplňkem albuminu. Bylo zjištěno, že ředicí efekt může být způsoben absencí bílkovinných stimulátorů pohyblivosti v semenné plasmě a sérový albumin působí právě jako stimulátor pohyblivosti spermií. Také doplněk draselných iontů K+ napomáhá k udržení pohyblivosti spermií, jelikož vysoká koncentrace těchto iontů v semenné plasmě je esenciální pro životaschopnost spermií. Draslík napomáhá k udržení funkčnosti sodíko-draselné pumpy buněčných membrán, která zabraňuje vnitrobuněčnému odsávání K+, což by jinak vedlo ke ztrátě pohyblivosti spermií.
Skladba ředidel
Důležitými prvky, které hrají významnou roli v zachování životaschopnosti spermií jsou: pH, iontová stabilita, typ iontů a osmotický tlak media.
V čerstvě ejakulovaném kančím spermatu kolísá pH mezi 7,2 až 7,5. Pokles pod tyto hodnoty způsobuje snižování metabolické aktivity spermií a prodlužování jejich přežitelnosti. Tohoto poklesu je dosahováno vysokým obsahem glukózy v ředidlech pro kančí sperma, který způsobuje rychlé snížení vnitrobuněčného pH pod 6,0. Tato vnitrobuněčná acidóza zřejmě umožňuje buňkám, aby přežily skladování několik dní při okolní teplotě.
Iontová stabilita ředidla není pravděpodobně tak důležitá pro kančí sperma, jelikož osmotický tlak je udržován převážně neiontovými komponenty (například glukózou). Významnými ionty v přirozeném prostředí pro kančí sperma jsou sodný iont Na+ (bikarbonát sodný nebo citrát sodný) a draselný iont K+ (chlorid draselný), které působí jako tzv. sodíko-draslíková pumpa a tím také jako pufry (v přeneseném slova smyslu též jako nárazníky), tj. jako činitelé udržující konstantní hodnotu pH roztoku. Vzhledem k tomu, že bikarbonát sodný působí též jako iniciátor v procesu kapacitace spermií a při skladování spermií je kapacitace nežádoucí, jsou novější ředidla založená na organických pufrech, označovaných jako TES a HEPES, které zachycují těžké kovy a regulují pH.
Kančí spermie tolerují relativně široký okruh osmolality (osmolalita je definována jako látkové množství osmoticky aktivních částic rozpuštěných v 1 kg vody), tj. mezi 240 až 380 mosM, avšak izotonické prostředí (tj. se stejným osmotickým tlakem) nebo mírně hypertonické prostředí (s vyšším osmotickým tlakem) nabízí lepší ochranu spermií než některá silně hypertonická ředidla, jakým je například ředidlo Androhep.
Ačkoli kančí sperma bývá uskladněno v kapalném stavu při teplotě 15 až 18 °C (tj. ve stavu anabiózy spermií), byla vyvinuta řada ředidel, které snižují metabolickou aktivitu spermií pomocí CO2. Například ředidlo IVT (Illinois Variable Temperature), vyvinuté v roce 1950 pro uchování býčího spermatu a modifikované pro kančí sperma, obsahuje glukózu, citrát, uhličitan sodný, vaječný žloutek a roztok je nasycený s CO2. Medium, doplněné chloridem draselným, je stále užívané jako „post-ředidlo“ ve dvoustupňovém ředicím systému.
V tabulce je uvedena skladba některých ředidel. EDTA (Etyléndiamin-tetra-kyselina octová) je sloučenina, která se přidává do ředidel, aby zachytávala bivalentní kovové ionty, zejména Ca2+, a omezovala tak jejich přesun přes cytoplazmatickou membránu, což slouží jako prevence před iniciací kapacitace a akrozomové reakce. V současné době je jedním z nejznámějších ředidlo BTS (Beltsville Thaw Solution), vyvinuté Purselem a Johnsonem (1975) pro rozmrazování kančích spermií zmrazených ve formě pelet a později adaptované pro kapalné skladování. Toto ředidlo obsahuje ve zvýšené míře draslík, který jak již bylo uvedeno výše, hraje roli v udržení vnitrobuněčné koncentrace těchto iontů na fyziologické úrovni po dobu skladování. Ředidlo ZORLESCO je poměrně komplexní medium, obsahující tři pufry (kyselina citronová, sérový albumin a cystein), dále glukózu a EDTA a ředidlo Androhep obsahuje organický pufr HEPES. Posledně zmiňované ředidlo je užívané pro pětidenní uskladnění spermatu a kapalná extenze je jednoduchá, protože ingredience mohou být zředěny vysoce kvalitní vodou.
Aby se zabránilo růstu mikroflóry v uskladněném spermatu, doplňují se do ředidel antibiotika. V současné době se přidává gentamycin (300 mg/l) nebo neomycinsulfát (1 g/l), nahrazující penicilin a streptomycin. Legislativní rozhodnutí Evropské unie předepisuje používání efektivní kombinace antibiotik, především proti bakteriovým kmenům Leptospira a Mycoplasma, která musí mít efekt alespoň ekvivalentní jako kombinace 500 m.j./ml penicilinu, 500 m.j./ml streptomycinu, 150 mg/ml lincomycinu a 300 mg/ml spectinomycinu.
Délka skladování
Strukturální a funkční změny spermií při kapalném skladování kančího spermatu se podobají procesu přirozeného stárnutí a mohou být ovlivňovány prostředím a délkou skladování. Stárnutí spermií nastává během skladování in vitro a pokračuje in vivo po inseminaci tím déle, čím delší je interval mezi inseminací a ovulací. To znamená, že úspěch oplodnění je ovlivněn dvěmi periodami stárnutí: in vitro a in vivo.
Posuzování stárnutí spermií podle funkčních změn jednotlivých organel buňky jako jsou mitochondrie, bičík, akrozom a cytoplazmatická membrána, není stále prozkoumáno. Hlavním indikátorem, podle kterého se posuzuje stárnutí spermií, bylo a zůstává snížení jejich pohyblivosti během skladování. Pokles ATP a cAMP (což jsou důležité prvky přenosu energie v buňce), stejně jako i snížení absorpce vápníku, jsou charakteristické pro sníženou pohyblivost spermií. Stejně jako změny v membránové propustnosti, jako například zvýšená propustnost barviv a uvolňování vnitrobuněčných substancí. Pokles záporných nábojů také dává indikace stárnutí. Tento pokles je vysvětlován probíhající peroxidací lipidů, jelikož fosfolipidy membrán kančích spermií obsahují vysoké množství nenasycených mastných kyselin. Tato peroxidace způsobuje poškození buněčných membrán. Ve fyziologickém prostředí je těmto změnám bráněno ochrannou rolí seminálních antioxidantů.
Monitorováním ovulace pomocí sonografu bylo zjištěno, že inseminace s kapalným spermatem provedená do dvou dnů po odběru nesnížila úroveň plodnosti se stoupajícím intervalem mezi inseminací a ovulací. Avšak, když bylo sperma uskladněno déle než 48 hodin, nastalo snižování procenta březosti, které bylo tím větší, čím delší byl interval mezi inseminací a ovulací. Jelikož snížení oplozovací kapacity spermií zásluhou in vitro stárnutí nemůže být zcela zabráněno, je nutné klást zřetel i na zlepšování inseminačních postupů se speciálním důrazem na dobu inseminace vzhledem k ovulaci, stejně jako na selekci kanců s vysokou kvalitou spermatu. Jen tak lze dosáhnout požadovaných výsledků v plodnosti po inseminaci s kapalně uskladněným spermatem.
Pro ředění kančího spermatu existují různé druhy ředidel, avšak jako obecné pravidlo by mělo platit, že pokud se používá sperma do dvou dnů po odběru, měl by se podíl porodů pohybovat v rozmezí alespoň od 65 do 70 %, a kolem 50 % s pětidenním spermatem.
Počet spermií
Počet spermií hraje důležitou roli v oplodnění a je závislý na výchozí kvalitě spermatu a jeho ošetření (tj. ředidlo, stáří spermatu). Z komerčního hlediska je cílem udržet spermie v životaschopném stavu po dostatečně dlouhou dobu a minimalizovat jejich počet v dávce. Určení této minimální hranice bylo cílem řady výzkumů. Tak bylo například pozorováno, že pokud počet spermií v dávce byl snížen ze 2x109 na 0,5x109, snížilo se procento březosti z 90 na 58 %. V jiném pokusu mělo snížení spermií v dávce na 0,3x109 za následek pokles normálně vyvinutých embryí na 60 %. To potvrzuje teorii, že nízké počty spermií v místě oplodnění sníží svoji vzájemnou konkurenci a tím se umožní, aby se méně schopné spermie účastnily oplodnění vajíček, avšak takovéto spermie už nejsou schopny zabezpečit normální embryonální vývoj. Na druhé straně bylo také zaznamenáno, že negativní důsledky nízkého počtu spermií v dávce, způsobené dlouhodobým skladováním, lze částečně překrýt zdvojnásobením počtu spermií v inseminační dávce. Tento postup však obvykle není využitelný v komerční sféře.
Obecně se doporučuje, aby jedna inseminační dávka obsahovala asi 3x109 spermií v 80 ml roztoku, v ČR se poslední dobou používá 1,5x109 spermií v dávce. Pokud odběr a inseminace probíhají přímo na farmě, inseminují se zpravidla vyšší počty spermií, jelikož převládá tendence spermie neskladovat. Častá je též heterospermie, tzn. míchání spermatu od rozdílných kanců, což také vede k používání vyššího počtu spermií.
Načasování inseminace vzhledem k ovulaci
Životaschopnost gamet v samičím genitálním traktu je chápana jako časový interval, během kterého je zachována jejich schopnost normálního oplodnění, tj. vzniku životaschopného embrya. Délka tohoto intervalu je závislá na mnoha faktorech (jako například na kvalitě a počtu spermií, stavu samičího genitálního traktu, sezóně, managementu a zručnosti inseminátorů) a je časově omezená, proto je správné načasování inseminace vzhledem k ovulaci kritické pro dosažení žádoucí úrovně plodnosti. Nevhodná doba inseminace před ovulací snižuje březost a velikosti vrhu, jelikož stárnoucí spermie buď neoplodní v dostatečné míře uvolněná vajíčka, nebo je sice oplodní, ale jejich potenciál již nestačí zajistit normální embryonální vývoj.
Životnost spermií v samičím genitálním traktu by neměla být přeceňována, doporučuje se, aby časový interval mezi dvěmi inseminacemi a mezi poslední inseminací a ovulací nebyl delší než 12 až 18 hodin. Dlouhodobé in vitro skladování spermatu před inseminací snižuje životnost spermií in vivo a vyžaduje proto přesnější načasování inseminace v porovnání s čerstvým spermatem. Ovulované ovocyty mají též omezenou životnost v samičím genitálním traktu. I když úspěšné oplodnění prasečích ovocytů bylo pozorováno s inseminací provedenou čtyři nebo dokonce osm hodin po ovulaci, je dokázáno, že míra prasení se snižuje úměrně se stárnutím ovocytů. Proto se doporučuje, aby inseminace nebyla prováděna později než dvě hodiny po ovulaci. Navíc krátce po oplodnění také nastává efektivní blokáda proti polyspermii.
Bylo pozorováno, že u prasnic může interval od nástupu říje do ovulace kolísat v širokém rozmezí (od 19 do 120 hodin). Avšak byl publikován průkazný vztah mezi nástupem říje po odstavu, délkou říje a dobou ovulace. Ukazuje se, že dřívější říje po odstavu má obvykle delší interval na rozdíl od pozdní říje, která je krátké délky. To naznačuje, že inseminační strategie by měla být přizpůsobena individualitě zvířat, prasnice s časnou říjí mohou být inseminovány později, prasnice s pozdní říjí by měly být inseminovány ihned po detekci říje.
V příštím článku budou uvedeny některé specifické aspekty týkající se skladování spermatu v mrazeném stavu (tzv. kryokonzervace).
Ing. Jaroslav Smital, VÚŽV, Praha -Uhříněves
