Kančí sperma se liší od spermatu ostatních druhů domácích zvířat zejména velkým objemem a extrémní citlivostí spermií na prudké ochlazení bezprostředně po odběru.
Tyto a další aspekty kančího spermatu vyžadují specifický přístup při jeho zmrazování a úspěšnost je závislá na pochopení faktorů a jejich interakcí, které ovlivňují schopnost spermií přečkat zmrazení a rozmrazení. Tyto faktory mohou být rozděleny na dvě kategorie: jednak vnitřní neboli stálé faktory, jako jsou vrozené charakteristiky spermií, vrozené rozdíly mezi ejakuláty a kanci, a jednak vnější faktory jako skladba ředidla, typ a koncentrace ochranných činitelů, poměr ředění, ekvilibrace, metody zmrazování a rozmrazování spermatu. O některých výše uvedených faktorech bylo podrobněji pojednáno v předchozím článku (Náš chov 12/2001), v tomto příspěvku bude věnována pozornost těm faktorům, které jsou specifické pro skladovaní spermatu v mrazeném stavu.
Mrazené kančí sperma je komerčně dosažitelné od roku 1975 v peletách nebo pejetách. Avšak zhruba jen 1 % ze všech inseminací je děláno zmrazeným a následně rozmrazeným spermatem. Nejčastěji se tohoto způsobu využívá pro účely zušlechťování genetické základny v jednotlivých zemích či stádech importem spermatu z jiné země.
V současnosti jsou ve světě komerčně používané dvě zmrazovací metody pro konzervaci kančího spermatu: jsou to tzv. beltsvillská a Westendorfova metoda. V prvním postupu, vyvinutým Purselem a Johnsonem (1975), je frakce ejakulátu bohatá na spermie ponechána (asi 2 hodiny) po odběru pod ochranou semenné plasmy a dále, po odstřeďování a chlazení (asi 3 hodiny), je sperma granulované na suchém ledu (0,15 až 0,20 ml/peleta). Ve Westendorfově postupu (1975), který byl upravený pro komerční použití, je sperma zředěné (1 díl spermatu ku 2 dílům ředidla) a vychlazené v ředidlu Hülsenberg 8 a následně zmrazené do pejet (tyčinek). Porovnání účinnosti obou metod kryokonzervace kančích spermií bylo v minulých letech předmětem intenzivního studia a uvádí se, že v kvalitě spermatu po rozmrazení, úrovni zabřezávání a plodnosti nejsou mezi oběma metodami průkazné rozdíly, které by upřednostnily praktické použití jedné z nich.
Ředidla a ochranné látky
Poslední dobou byly vyvinuté různé druhy ředidel pro skladování kančího spermatu v mrazeném stavu, většinou modifikované pro konkrétní podmínky. Obvykle se ředidla skládají z cukrů, proteinů a lipoproteinů, pufrů, kryokonzervačních přísad a činidel. Skladba jednotlivých ředidel je sice různá, ale většina je charakterizována nízkou koncentrací glycerolu.
Jako ochranné látky v kančích ředidlech byly testovány různé chemické sloučeniny (například xylit, acetamid), ale žádná neprokázala lepší účinky než glycerol. Ten je také používaný pro ochranu spermií většiny savců, avšak kančí spermie jsou citlivější na vysoké koncentrace glycerolu než spermie ostatních druhů zvířat. Koncentrace glycerolu, poskytující nejlepší podmínky pro kryokonzervaci spermií z hlediska jejich pohyblivosti, je nevýhodná pro udržení celistvosti membrán akrozomů. Glycerol je obvykle dodáván při vychlazení částečně zředěného spermatu na 5 °C. Nedávné pokusy přinesly výsledky, že kančí sperma není nutné ekvilibrovat zároveň s glycerolem, ale že glycerol se může dodat kdykoli před zmrazováním, jelikož rychle infiltruje do spermií.
U mnoha druhů hospodářských zvířat poskytuje dostatečnou ochranu spermiím proti teplotnímu šoku vaječný žloutek, avšak u kančích spermií není jeho ochranná funkce tak spolehlivá. Proto se ochranný efekt vaječného žloutku zlepšuje přidáním syntetických detergentů a antioxydantů. Vystavení kančích spermií prudkému poklesu teploty okolního prostředí bezprostředně po odběru způsobuje poškození integrity buněčných membrán, má za následek uvolnění vnitrobuněčných enzymů, lipidů a přerozdělení iontů, což vše v konečném důsledku vede ke snížení pohyblivosti a životaschopnosti spermií. Teplotní šok, jak je tento jev obecně nazýván, je závislý na rychlosti chlazení a na konečné teplotě, do které má být sperma vychlazené. U kančích spermií se dosahuje rezistence k mrazení zejména inkubací při okolní teplotě po několik hodin (zpravidla po 2 až 7 hodin).
Rychlost mrazení
Při snižování teploty roztoku spermií a ředidla se v určitém okamžiku začne formovat led. Vnitrobuněčný obsah spermií setrvává po nějakou dobu kapalný, jelikož membránové systémy blokují rozšíření ledu. Při dalším poklesu teploty podchlazená buněčná voda v reakci na zvýšený diferenční osmotický tlak difunduje mimo buňku a mrzne. Rychlost tohoto difundování závisí jednak na stálých vnitřních faktorech, jako jsou propustnost buněčných membrán pro vodu a glycerol, objem a povrch buňky, a jednak na vnějších, ovlivnitelných faktorech, kterými jsou rychlost zmrazování a koncentrace kryoprotektorů (tj. látek chránících spermie před nežádoucími účinky zmrazování). Jestliže je rychlost zmrazování přiměřená, jsou spermie schopny zbavovat se mrznoucí vody osmózou, čímž dehydratují a nevznikají vnitřní ledové krystaly, které jsou jinak hlavní příčinou poškození buněk zejména při prudkém zmrazování. Zničení buněk může v podstatě nastat následkem dvou příčin: dehydratací nevhodnou rychlostí, která nastává při expozici buňky vysokým koncentracím rozpuštěných látek v okolním prostředí a vnitrobuněčným tvořením ledu, je-li sperma mrazeno příliš rychle. Optimální rychlost zmrazování je obvykle kompromisem mezi těmito dvěma extrémy.
Interakce mezi koncentrací glycerolu a rychlostí mrazení byla popsaná pro kančí sperma Fiserem a Fairfullem (1990). Autoři zjistili invertní U-tvar křivky přežívání kančích spermií zmrazovaných rychlostí v rozmezí od 1 °C do 1500 °C/min. Optimální rychlost mrazení dosahuje vyšších hodnot procenta pohyblivých spermií i při nízkých koncentracích glycerolu. Při jednotlivých úrovních glycerolu, spermie toleruje určité rozmezí rychlosti mrazení bez znatelných změn v dalším životě. Bylo také prokázáno, že optimální koncentrace glycerolu je různá pro jednotlivé parametry vyšetření. Pro pohyblivost spermií byla nejlepší koncentrace glycerolu 3 až 4 %, kdežto pro akrozomovou celistvost byla optimální koncentrace 0 až 1 %. Naproti tomu byla nejlepší rychlost mrazení pro oba parametry (pohyblivost a akrozom) 30 °C/min. Proto při konzervaci spermatu doporučili autoři pro obě komponenty kompromis: 3 % glycerolu a rychlost mrazení 30 °C/min.
Rychlost rozmrazování
V současnosti je kančí sperma mrazené zejména ve formě kuliček na suchém ledu, nověji v maxi-tyčinkách za využití páry zkapalněného dusíku. Uvádí se, že přežitelnost spermií po rozmrazení je lepší v kuličkách než v maxi-tyčinkách, jelikož u nich nelze, kvůli jejich tloušťce, dosáhnout optimální rychlost rozmrazení. Efektivita rozmrazování spermií je závislá především na způsobu zmrazování, avšak důležitým faktorem působícím na přežívání spermií je rychlost rozmrazování až do požadované teploty.
Pohyblivost spermií a integrita akrozomů se v kančím spermatu mrazeném optimálním způsobem zlepšuje se stoupající rychlostí rozmrazování. Pomalé rozmrazování způsobuje růst drobných krystalek ledu a tudíž je vysoká rychlost zahřívání esenciální pro přežitelnost spermií po rozmrazení. Vliv rozmrazování na akrozom je ovlivněn i koncentrací glycerolu, vyšší koncentrace jsou více škodlivé k integritě akrozomu.
Jen malý podíl spermií mrazených v nevhodných podmínkách se ujme ať už po pomalém nebo po prudkém rozmrazení. To znamená, že kančí spermie jsou již kriticky porušené nevhodným mrazením a jen málo jich lze zachránit optimálním rozmrazováním. Efektivní kryokonzervace vyžaduje optimální kombinaci všech tří proměnných (koncentraci glycerolu, rychlost mrazení a rozmrazení). Vzhledem k zachování pohyblivosti spermií a zároveň i integrity jejich akrozomu se doporučují následující hodnoty: 3 % glycerolu, rychlost zmrazování (v rozsahu mezi 0 °C až až 50 °C) 30 °C/min a rychlost rozmrazování 1200 °C/min.
Výsledky plodnosti s kryokonzervovaným spermatem
První úspěšné pokusy se zabřeznutím po inseminaci s kryokonzervovaným kančím spermatem byly zaznamenány kolem roku 1970, zpočátku použitím chirurgické inseminace do vejcovodu, později po cervikální inseminaci s rozmrazeným spermatem.
Několikaletá nizozemská studie zabřezávání prasnic po inseminaci s čerstvým a mrazeným spermatem ukázala, že podíl březosti byl 47 % a počet selat ve vrhu průměrně 7,4 kusů po použití kryokonzervovaného spermatu oproti tomu s čerstvým spermatem byl dosažen podíl březosti 79 % a počet selat ve vrhu 10,6 kusů.
V letech 1970 až 1985 se dle literárních zdrojů pohyboval průměrný podíl březosti 55 % a počet selat ve vrhu 8,3 kusů v případě použití pelet (kuliček) a pro tyčinky 58 % březost a 9,0 selat ve vrhu. V Norsku byly publikovány výsledky komerčního používání mrazeného kančího spermatu za pětileté období při používání maxi-tyčinek a dvojité inseminace, a to 48 % podíl březosti a 10,4 selete ve vrhu.
Za účelem zlepšení míry prasení a velikosti vrhu s mrazeným spermatem je zapotřebí inseminovat co nejblíže ovulace, proto se v současnosti využívá dvojitá inseminace: první asi 30 hodin po detekci říje a druhá o 10 až 12 hodin později. Komerčně, pro produkci porážkových prasat není používáno zmrazené sperma kvůli nižší úrovni zabřezávání a menšímu vrhu v porovnání s čerstvým (respektive v kapalném stavu uskladněným) spermatem. Tento fakt limituje používání kryokonzervovaného spermatu, ale na druhé straně má tento způsob skladování spermatu nezanedbatelný význam z hlediska mezinárodního transportu genetického materiálu, pomocí něhož je světová populace prasat kontinuálně zušlechťována, a v neposlední řadě i z hlediska ochrany proti nákazám či jiným živelným pohromám.
Závěrem lze shrnout, že úspěšnost skladování kančího spermatu, ať už v kapalném či mrazeném stavu, ovlivňují zejména následující faktory:
Výchozí kvalita spermatu (pohyblivost a celistvost akrozomů)
Okolní teplota (teplotní šok)
Ředění a skladba ředidla
Délka skladování (krátkodobá nebo dlouhodobá)
V případě dlouhodobého skladování:
Koncentrace kryoprotektorů (glycerol)
Metoda kryokonzervace (pelety, pejety, aj.)
Rychlost mrazení (dostatečně pomalá)
Rychlost rozmrazení (dostatečně rychlá)
Počet inseminovaných spermií (čím déle je sperma uskladněno, tím vyšší počet spermií při inseminaci)
Načasování inseminace vzhledem k ovulaci (čím horší sperma tím větší nároky na přesnost načasování a způsob inseminace)
Zpracováno za podpory Mze ČR (výzkumný projekt MZe-MO2-99-02).
Ing. Jaroslav Smital, Výzkumný ústav živočišné výroby, Praha -Uhříněves
