Genetika a reprodukce jako základní funkční předpoklady úspěšné produkce hospodářských zvířat se staly v uplynulých desetiletích hlavním objektem biotechnologického výzkumu. Řada biotechnologických postupů se dnes již uplatňuje běžně v praxi – slouží nejen ke zvýšení efektivnosti produkce; jsou využívány rovněž pro zachování genových rezerv, zvyšování kvality produkce, k vývoji nových produkčních systémů apod.; jiné postupy čekají na své uplatnění, další jsou ve stadiu výzkumu a vývoje.
Běžně používané technologie jsou v živočišné výrobě využívány k:
1. efektivnějšímu využívání produkce zárodečných buněk – samčích a samičích,
2. výměně genetického materiálu (zmrazené semeno a embrya) v rámci celosvětového trhu,
3. uplatnění hygienických koncepcí prostřednictvím umělé inseminace a ET,
4. urychlení genetického pokroku uplatněním integrovaných šlechtitelských programů založených na biotechnologických metodách,
5. zlepšení kvality produkovaných výrobků a jejich inovaci.
V budoucnu se předpokládá využití těchto metod i v dalších oblastech:
1. chov zvířat s optimálními genetickými parametry (obecné ukazatele produkce, specifické produkční parametry). K tomu účelu bude využita integrovaná aplikace biotechnologických metod (AI, ET) a biotechnologických metod a zároveň selekce založená na analýze genomu;
2. tvorba specifických produkčních vlastností zlepšujících technickou zpracovatelnost surovin a příznivě působících na zdravotní stav a kondici konzumentů potravin využitím transferu genů;
3. nové perspektivy využívání hospodářských zvířat k bioléčebným účelům, například pro syntézu farmaceutických proteinů v mléčné žláze transgenních zvířat a pro produkci transgenních prasat – dárců vhodných orgánů pro xenotransplantace;
4. využívání klonování jako prostředku pro identické množení geneticky cenných jedinců;
5. zachování genetické diverzity (rozmanitosti) zvířat uplatněním integrovaných koncepcí zahrnujících biotechnologickou konzervaci zárodečných buněk, embryonálních buněk a dokonce i somatických buněk a DNA.
V této souvislosti je však nezbytné zmínit se o etických aspektech spojených s potenciální realizací uvedených záměrů. Řada otázek je také spojena s možnostmi převzetí biotechnologických metod uplatňovaných v produkci zvířat a jejich aplikaci u lidí (především IVF a techniky navazující, transfer genů a klonování). Tyto problémy je třeba brát vážně; jejich ignorování, případně zlehčování by mohlo vést k nežádoucím politickým rozhodnutím a intervencím poškozujícím další vývoj těchto nesporně progresivních a významných postupů. Je proto třeba postupovat citlivě a v souladu s etickými normami.
Stav a perspektivy vývoje biotechnologií v genetice a reprodukci
V oblasti živočišné výroby se v současné době uplatňují následující technologie: AI a ET jako standardní metody u většiny chovaných druhů hospodářských zvířat; dále kontrola říje, ovulace a porodu, odběr a konzervace semene, získávání oocytů a embryí konvenčními, ale i zcela novými metodami (COC), mikromanipulace s gametami a embryi, kryokonzervace gamet a embryí IVM, IVF, IVC, analýza genomu a transfer genů.
V budoucnu se předkládá další zlepšování genetického potenciálu uplatněním integrovaných plemenářských programů na bázi AI, MOET, sexování, klonování a IVP embryí, využívání transgenních zvířat k nekonvenčním produkčním účelům, ke zlepšení zdravotního stavu, k uplatnění specifických znaků; dále využití analýzy genomu k přesnému stanovení plemenných hodnot, ke zlepšení genetického zisku a pokroku, eliminaci genetických poruch a geneticky podmíněných chorob apod.
a) Kryokonzervace zárodečných buněk a embryí
Současný výzkum se soustřeďuje především na kryokonzervaci embryí a oocytů, která je stále v experimentálním stadiu. S rozvojem in vitro technik je také spojena nutnost pečlivé analýzy produkovaných jedinců, která má za úkol vyhledat potenciální nežádoucí vedlejší účinky uplatňovaných metod. Nelze pominout skutečnost, že kombinace dvou biotechnologií (například IVM, IVF, IVC a kryokonzervace) je spojena se zvýšeným výskytem negativních vedlejších účinků na produkované potomstvo. Vedle již „klasické“ rutinní kryokonzervace semene se začíná úspěšně uplatňovat i kryokonzervace embryí; podobně jako v případě zmrazování semene není metoda stejně úspěšná u všech druhů hospodářských zvířat. Vývoj úspěšných metod kryokonzervace zárodečných buněk a embryí je nezbytným předpokladem zachování genetické diverzity hospodářských zvířat.
b) Získávání oocytů, in vitro zrání, oplození, kultivace – OPU a IVM, IVF, IVC
S nástupem technologie IVF vyvstala potřeba odběru oocytů nejen z poražených dárkyň, ale i z dárkyň živých. Metoda aspirace folikulů pomocí ultrazvukového zařízení umožňuje realizovat opakovaný odběr oocytů bez nepříznivých vedlejších účinků, které jsou zjišťovány v případě laparoskopické metody odběru. Opakované aspirace životaschopných COC v krátkých intervalech jsou vcelku bezproblémové a úspěšné. Tato metoda umožňuje detekovat a aspirovat větší množství folikulů než v případě aplikace běžné laparoskopické metody. Tuto metodu lze navíc využít například i u prepubertálních zvířat; podíl embryí schopných dalšího vývoje je však stále ještě nižší v porovnání s dospělými zvířaty. Významného pokroku bylo dosaženo v přípravě médií pro IVM, IVF a IVC. Velký význam se přikládá proteinovému doplňku médií. Je zřejmé, že tento doplněk redukuje embryotoxicitu produktů embryonálního metabolizmu nebo doplňků média, slouží jako zásobník živin potřebných pro vývoj embrya a napomáhá růstu a množení buněk. Výzkum optimálního složení efektivního kultivačního média pro in vitro produkci bovinních embryí nadále pokračuje; případná aplikace jednoho druhu média pro různé živočišné druhy by značně zjednodušila metodické postupy, porovnávací studie fyziologie a metabolizmu embrya atd.
Metoda IVP se doporučuje pro čistokrevné i křížené populace skotu; pokud je využívána v rámci plemenářských programů, potom je samozřejmě nezbytná pečlivá identifikace dárkyň. Tato metoda by mohla být také velmi efektivní v případě produkce dvojčat u masných plemen skotu a při křížení skotu chovaného v tropických oblastech. Vývoj nových metod a zjednodušení postupu IVP by výrazně napomohlo využití této metody v komerčních programech. V této souvislosti je však třeba připomenout, že úspěšnost IVF a časného embryonálního vývoje je významně ovlivněna použitou inseminační dávkou (existující rozdíly nejen mezi plemeníky, ale i mezi dávkami téhož plemeníka).
c) Sexace embryí a spermií
Pohlaví embrya lze stanovit několika metodami, které však až na výjimky nejsou zatím uplatňovány ve větší míře. Účinnost by se mohla výrazně zvýšit uplatněním dělení (klonováním) embryí daného pohlaví. Nadějné výsledky jsou uváděny v případě metody průtokové cytometrie, kdy jsou populace spermií separovány na bázi specifických parametrů determinujících pohlaví. Podle posledních údajů z chovu prasat je možná separace spermií imunologicky na principu antigen – protilátka.
d) Klonování transferem nukleí
U savců lze teoreticky získat geneticky identické potomstvo mikrochirurgickým dělením embrya, izolací a rozmnožením nebo agregací jednotlivých blastomer a přenosem nuklea. V případě hospodářských zvířat se jeví jako optimální metoda přenosu jader. Většina jedinců narozených po přenosu nukleí se vyznačuje normální velikostí a uspokojivým zdravotním stavem; u asi 30 % však byly zjištěny abnormality například nadměrný růst plodu spojený s prodlouženou březostí apod. V případě, že se podaří uvedené problémy vyřešit a zvýšit úspěšnost přenosu, měla by tato technologie být významným přínosem pro oblast živočišné výroby. To platí především pro produkci transgenních zvířat využívaných pro xenotransplantace nebo syntézu farmaceutických proteinů v mléčné žláze. Je třeba zaměřit úsilí na zvýšení využitelnosti této poněkud komplikované biotechnologické metody v zájmu zdraví lidí i zvířat.
e) Analýza genomu
Molekulární genetika byla v posledních 20 letech předmětem extenzívních studií. Analýza genomu hospodářských zvířat poskytla řadu nových poznatků o molekulové struktuře genů a také nové informace o jejich regulaci a působení. Tyto znalosti umožňují provádět selekci genů a aplikovat metodu genového transferu. Většina znaků, které se významně uplatňují v produkci, má však kvantitativní charakter a je ovlivněna řadou různých lokalizací genů. Aplikace analýzy genomu na této úrovni by spolu s populační genetikou mohla umožnit vývoj nových, efektivnějších šlechtitelských postupů a programů. V porovnání s běžně uplatňovanou selekcí by se v tomto případě také výrazně snížilo, případně zcela vyloučilo riziko nežádoucích vedlejších účinků. V současné době jsou k dispozici výsledky prvních rutinních aplikací diagnostiky DNA.
f) Transfer genů
Transgenní zvířata jsou nositeli rekombinantních molekul DNA. Transfer genových seskupení (konstrukcí) se provádí mikroinjekcí do pronukleí oplozených oocytů, přenosem DNA elektroporací nebo inkorporací do semene, které začlení inkorporovanou genovou konfiguraci do vajíčka při procesu oplození nebo vektorem. Mikroinjekce aplikované do pronukleí jsou v současné době stále nejužívanější a nejsledovanější z uvedených metod. Vysoké náklady jsou do jisté míry odrazem stále velmi malé úspěšnosti postupu, která dosahuje pouze 1 až 4 %. Transferu genů se u hospodářských zvířat užívá ke zlepšení růstových parametrů, zvýšení rezistence vůči onemocnění, k zabezpečení produkce surovin se speciálními parametry apod. Další využití této metody je v oblasti bioléčebné – jde především o produkci farmaceutických proteinů a produkci transgenních prasat – dárců orgánů pro xenotransplantaci.
Závěrem je třeba dodat, že jsem se orientoval na prioritní a perspektivní směry a možnosti. Doufám rovněž, že pokud se budou směry budoucího výzkumu a využití lišit, bude to posuzováno jako výsledek upřesňujících výzkumů a upřesněné orientace. Vždy však bude nezbytné využití poznatků fyziologie reprodukce, získat, využít a manipulovat s pohlavními buňkami a embryi a konečně dokázat je s vysokou úspěšností přenést vhodné recipientce a v tom bude úloha dnešních specialistů rovněž nezastupitelná. Dále bude následovat porod, odstav a testace některých jedinců. Cesta k úspěchům je dlouhá se spoustou obtížných bodů a křižovatek.
Výsledky ET u chovaných druhů hospodářských zvířat
Skot – dojená populace
Praktické používání ET u dojených plemen je cíleno na genetické zvyšování úrovně chovaných plemen s využitím předností, které ET nabízí. Na konci 80. let byla produkována ET téměř třetina býčků pro odchovny a plemenitbu. Po roce 1989 došlo k útlumu ve využívání metody ET. Posledních pět let je využíván ET k cílené produkci plemenného materiálu díky dotační politice MZe ČR a v současné době se produkuje asi pětina býčků do odchoven. Současně se rozvíjí i dovoz embryí špičkových rodičovských párů, z nichž je prvních 25 plemeníků v testačním připařování. V současné době se k ET využívají v obou dojených populacích téměř výhradně matky býků. Získáváme od nich v průměru 8 až 10 vajíček, z toho 5 až 8 vhodných embryí, přežívání embryí po přenosu činí 55 až 70 %, po přenosu konzervovaných embryí od 53 do 67 % podle způsobu zmrazování, kategorií a plemene dárkyň. Od jalovic špičkových rodičovských párů získáváme od 4 do 7 vhodných embryí se 70% přežíváním embryí po přenosu.
S propracováním metody OPU, IVP embryí a dalších nových technik má největší zkušenosti pracoviště vývoje ČMSCH v Brně. Na našem pracovišti byly získány první zkušenosti s těmito technikami a ve společných experimentech jsme přenesli čerstvá a konzervovaná IVP embrya s úspěšností 45 a 34 %, celkově pak 60, 50, 33 a 42 % podle účelu použití (tab. 1). Přednosti OPU-IVP ve porovnání s programem MOET jsou:
- možnost opakovaného získávání oocytů od donorek po relativně dlouhou dobu v období rané puberty a gravidity;
- výrazné zkrácení generačního intervalu;
- produkce embryí od neplodných krav nebo donorek s problémy při superovulaci;
- možnost rozšíření kombinací rodičovských párů.
Skot - masná populace
Superovulační schopnost dárkyň masných plemen je různá a zisk embryí je poněkud vyšší u krav než u jalovic se sezónním kolísáním. U skotu masných plemen jsme využili ET k tvorbě masných stád v různých variantách:
a) Dovoz embryí ze zahraničí. O úspěšnosti tohoto postupu rozhoduje především dobrý management chovu příjemkyň, kvalitní příprava na rozmrazování embryí při dodržení stanoveného postupu a médií. Zabřezávání příjemkyň činilo 20,0 až 80,0 %, cena vyprodukované jalovičky asi 66 % ceny dovezených zvířat při 50% dotaci na nákup embrya. (tab. 2)
b) Přenos embryí získaných ve vlastním stádě. Zabřezávání činilo podle plemen 44,7 až 83,3 %, cena vyprodukované jalovičky pomocí ET po přenosu vlastních embryí činila 25 až 33 % ceny dovezených zvířat. Je zřejmé, že při dodržení všech stanovených podmínek přípravy zvířat a technologických předpokladů lze dosáhnout odpovídajících výsledků. (tab. 3)
c) Založení stáda masného skotu nákupem čerstvých a zmrazených embryí. Zabřezávání činilo po přenosu čerstvých embryí 37,5 až 92,0 % podle plemen, po přenosu zmrazených embryí 41,5 až 63,3 %, cena vyprodukované jalovičky činila asi 33 až 40 % ceny dovezených zvířat při 50% dotaci na nákup embrya. (tab. 4)
d) Rozšíření vlastního stáda přenosem nezmrazitelných embryí. Zabřezávání činilo podle chovů 32,6 až 57,4 %, cena vyprodukované jalovičky pomocí ET činila 25 % ceny dovezených zvířat. (tab. 5)
U plemene piemontese byl proveden nejvyšší počet přenosů, a tak bylo možno provést i zhodnocení zootechnických parametrů (tab. 6 a, b, c, d).
Z výsledků je zřejmá technologická, chovatelská a ekonomická efektivnost založení a rozšíření stáda skotu masných plemen při využití přenosu embryí.
Determinace pohlaví embryí
Determinace pohlaví provádí v ČR dvě pracoviště a to ČMSCH, a. s. v Hradišťku a Bovet Sloupnice; Jindra (1999, 2000) uvádí spolehlivost postupu při využití PCR metody v praxi ET technologie 95,1 %.
Dělení embryí
V ČR byl vypracován velice úspěšný a technicky nenáročný způsob dělení embryí; ve VÚCHS Rapotín činilo zabřezávání příjemkyň propočtené na původní embrya 132 %.
Prasata
U prasat je spojeno používání embryotransferu s obtížemi plynoucími s fyziologických a morfologických odlišností ve funkci a stavbě reprodukčních orgánů a odlišnostmi v samotných embryích a v jejich požadavcích na kvalitu prostředí. Embrya byla získána post mortem od superovulovaných dárkyň. K nechirurgickému přenosu jsme použili inseminační sondu, kterou jsme provlékli silikonový přiměřeně rigidní katetr zakončený na druhé straně injekční stříkačkou s asi 3 ml kultivačního média. Recipientky byly synchronizovány buď zkrmováním přípravku Regumate a ošetřením preparáty PMSG a HCG (prasničky), nebo odstavem selat bez dalšího ošetření (prasnice na 1. a 2. vrhu). Pro ET laparoskopicky nebo nechirurgicky byly použity 6. den cyklu recipientky, které vykázaly reflex nehybnosti v čase inseminace dárkyň. Po 10 laparoskopických ET čerstvých embryí zabřezlo 5 prasnic, které porodily celkem 39 selat, z toho 37 živě a odstaveno bylo 34 selat. Po 13 laparoskopických ET vitrifikovaných embryí inseminovaným recipientkám zabřezlo 7 kusů, z toho 4 prasnice porodily pouze vlastní selata, u dalších bylo 5, 9 a 10 selat fenotypicky prokazatelně pocházejících z přenesených vitrifikovaných embryí. Z 13 provedených nechirurgických ET čerstvých embryí zabřezlo celkem 6 neinseminovaných recipientek – 3 synchronizované prasničky byly poraženy 28. den po říji se 4, 10, 4 plody z 10, 12, 12 přenesených embryí. Zabřezlá prasnice po 2. vrhu zmetala na konci 2. měsíce gravidity. Další porodila 10 selat z 19 přenesených embryí. Poslední recipientka porodila 6 živých selat z 11 přenesených embryí. Po 2 nechirurgických ET vitrifikovaných embryí zabřezla jedna příjemkyně, která po 117 dnech březosti porodila 6 selat, která byla odstavena.
Ovce
V chovu ovcí jsou biotechnologie využívány málo, a to z důvodů snížení stavů chovaných zvířat. Přesto někteří chovatelé tyto postupy využívají. U ovcí jsme provedli v průběhu let 1995 až 1999 stimulaci režimem CIDR, respektive tampony Intervet pFSH, respektive Ovagen u 37 bahnic. Laparoskopicky jsme získali od 9,25 ± ,79 do 12,67 ± 2,33 vajíček, ze kterých bylo od 6,25 ± 4,50 do 9,56 ± 3,86 vhodných embryí (od 68 % do 100 %) kromě skupiny dárkyň plemene cigája. Zabřezávání recipientek po laparoskopickém přenosu 1 až 3 embryí činilo 70,2 % (59/84), přežívání embryí 66,1 % (84/127). Při přenosu jednoho, dvou a tří embryí se zvyšovalo zabřezávání a produkce jehňat na zabřezlou bahnici, ale celkové přežívání embryí se snižovalo. Byly získány pozitivní výsledky při přenosu vitrifikovaných embryí. Po transferu 10 vitrifikovaných embryí byly březí tři z pěti recipientek (60 %). Po přenosu 36 zmrazených embryí klasickým způsobem v 10% glycerolu byly březí 4 z 18 příjemkyň (22,2 %). Hodnoty zjištěné u recipientek rutinně zmrazených embryí byly nižší než hodnoty zaznamenané u recipientek čerstvých a vitrifikovaných embryí. I přes pouze orientační charakter uvedených výsledků lze očekávat úspěšné využívání kryokonzervace a přenosu ovčích embryí v ČR.
Kozy
K superovulačnímu ošetření v reprodukční sezóně kombinací intravaginálních tampónů Intervet 40 mg Norgestomet na 14 dní a FSH-p v dávce 400 mj. v šesti stejných dávkách bylo vybráno 30 ročních, 25 dvouletých mohérových koz a 28 sánských bílých krátkosrstých koz různého věku. Dárkyně byly kryty vybraným plemeníkem z ruky. Odběr embryí byl prováděn 6. den po 1. krytí chirurgickým způsobem u ročních mohérových koz, u ostatních laparoskopicky doplněným Krebs-Ringer fosfátem, izolace a hodnocení embryí bylo prováděno běžnými embryologickými technikami.Od ročních bylo získáno průměrně 8,8 vajíčka (4,2 a 4,6 vajíčka z pravého a levého rohu), z toho bylo 7,5 přenosuschopných embryí (3,4 a 4,1 embryí z levého a pravého rohu, zbytek představují neoplozené oocyty, P>0,05). Podíl vhodných embryí ze získaných vajíček činil 85,3 %.Od dvouletých mohérových koz bylo získáno průměrně 8,8 vajíčka (93,6 %, 4,2 a 4,6 vajíčka z jednotlivých rohů), z toho bylo 7,5 přenosuschopných embryí (3,4 a 4,1; zbytek představují neoplozené oocyty). Podíl vhodných embryí ze získaných vajíček činil 85,3 %.Od sánských koz bylo získáno průměrně 17,7 vajíčka (104,1 %, 8,5 a 9,2 vajíčka), z toho bylo 8,3 přenosuschopných embryí (4,0 a 4,3 embryí; zbytek představují neoplozené oocyty). Podíl vhodných embryí ze získaných vajíček činil 46,0 % při vysoké stimulaci. Po přenosu čerstvých embryí v průběhu reprodukční sezóny jsme dosáhli 66,7 % zabřezávání příjemkyň a po přenosu čerstvých embryí mimo reprodukční sezónu pak pouze 10 % (P
Uvedené výsledky dávají předpoklad cíleného využití ET ve šlechtění populací hospodářských zvířat. Na základě teoretických propočtů a zkušeností z MOET systémů je však třeba přesně určit zvířata a rodičovské páry vhodné k cílenému užití pro reprodukční biotechnologie tak, aby šlechtitelský dopad do populací byl co možná nejvyšší.
V České republice disponujeme dostatečně početným kádrem erudovaných specialistů pro činnost na úseku přenosu embryí u skotu, kteří dosahují porovnatelné výsledky s Evropou i světem. Každá činnost popsaná i v předcházejících kapitolách vždy skončí tím, že bude potřebné kvalitně přenést embryo vhodné recipientce.
Výsledky a poznatky byly získány při řešení projektů podporovaných MZe ČR v projektech NAZV č. EP7157, 7158, 7159, QD0085, 0100, 0176 a MŠMT ME 212.
Doc. ing. Jan Říha, DrSc.
Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín
