Pro efektivní využívání kanců v chovu prasat je důležité zvyšovat počet produkovaných inseminačních dávek spermatu od jednoho kance a proto je výzkum zaměřen na stanovení maximálního stupně ředění a minimálního počtu spermií v inseminační dávce při zachování žádaného procenta zabřezávání a plodnosti. Vývoj nových ředidel je zaměřen na zdokonalování krátkodobé konzervace spermatu, s cílem prodloužit použitelnost inseminačních dávek po dobu několika dnů a na intenzivní výzkum dlouhodobé konzervace hlubokým zmražením spermatu.
Ředění kančího spermatu
Kančí sperma se ředí jednak z důvodu získání většího objemu a tím většího počtu inseminačních dávek, jednak z důvodu dodání výživných a ochranných látek spermiím. K ředění spermatu je v podstatě možno použít tři druhy ředicích roztoků. Jde o ředidla ze skupiny extendorů, dále protektorů a o ředidla označovaná jako implementory. Extendory jsou ředidla, která zvětšují jen objem spermatu. Pro uchování spermatu 24, 48 a 72 hodin nebo déle se používají složitější ředidla typu protektorů, jenž poskytují i živiny pro spermie, a implementory jsou vlastně protektory, ke kterým jsou přidány látky působící na pohlavní orgány prasnic.
Během posledních dvou desetiletí bylo vyvinuto velké množství různých ředidel kančího spermatu. Škála ředidel se ale časem zmenšuje, až jich zůstává jen několik, které mají význam pro celosvětový inseminační průmysl. V evropském společenství jsou chovy kanců lokalizovány regionálně tak, že sperma může být odebíráno, zpracováváno a dodáno spotřebitelům ve stejném dni. Díky této rozsáhlé síti a infrastruktuře mají evropské země zavedeny úspěšné programy inseminace s používáním krátkodobých ředidel. Naproti tomu v Severní Americe je ojedinělá situace, pokud se týče požadavků na uchování ředěného kančího spermatu, která je způsobená velkými vzdálenostmi a omezeným počtem chovů kanců. V závislosti na vzdálenosti od chovu kanců a způsobu dopravy spermatu je žádáno krátkodobě i dlouhodobě uchovávané ředěné sperma a zároveň s touto poptávkou jsou prodávána a používána rozmanitá krátkodobá a dlouhodobá ředidla.
Jak již bylo uvedeno, je prvotním účelem ředidla rozmnožit počet páření (tj. zvětšit objem) z daného kančího ejakulátu. V závislosti na typu může ředidlo plnit i další funkce, jako depozitář živin a energie, ochrana spermií proti teplotnímu šoku, regulace škodlivých vlivů kolísání pH, udržování správné osmotické rovnováhy a inhibice bakteriových vegetací. Ředidla kančího spermatu jsou tradičně členěna do dvou skupin na základě toho, jak dlouho mohou uchovat tekuté kančí sperma bez patrných ztrát v jeho plodnosti. Tyto skupiny zahrnují krátkodobá (méně než 3 dny) a dlouhodobá (déle než 3 dny) ředidla a kromě tohoto konzervačního potenciálu jsou rozdíly i v ceně ředidel (zejména kvůli různé skladbě medií).
Antibiotika v ředidlech kančího spermatu
V ředidlech kančího spermatu byla vyzkoušena a doporučena k používání celá řada antibiotik. Antibiotika jsou přidávána hlavně kvůli kontrole baktériových nárůstů v ředidle, jelikož kančí ejakuláty mají sklon se kontaminovat baktériemi během procesu odběru. Metabolické vedlejší produkty živelných baktériových nárůstů způsobují kolísání pH a podílí se tak významnou měrou na snížení životnosti spermií. V současné době není k dispozici žádné jednoduché antibiotikum, úspěšně působící na všechny baktérie, které mohou být přítomné ve vzorku spermatu. Volba antibiotika je tak založená na regulaci baktérií, které jsou přímo nebo nepřímo spermicidní. Baktérie, které obvykle kontaminují kančí ejakuláty zahrnují kmeny Escherichia, Pseudomonas, Micrococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Bacillus a Streptococcus.
Dříve obsahovala dost často kančí ředidla spermatu penicilín (0,35 g/l) a streptomycin (0,8 g/l). Tato kombinace antibiotik, která byla vybrána kvůli tehdy omezené nabídce a dostupnosti antibiotik, má limitující spektrum antimikrobiální činnosti. Dnes jsou již dostupná různá účinnější širokospektrální antibiotika k regulaci růstu baktérií a tak nepřímo i životnosti ředěného spermatu. Oblíbená antibiotika používaná dnes v prasečích ředidlech spermatu jsou gentamicin, lincomycin, neomycin a spectinomycin. Další přijatelná (ačkoli nákladnější) antibiotika jsou dibekacin, amikacin, ceftioufur, enrofloxacin, ampicillin a kanamycin. Nejpopulárnější konzervační antibiotikum v prodávaných prasečích ředidlech spermatu je gentamicin.
Konzervace kančího spermatu
Při konzervaci spermatu jsou spermie uvedeny do stavu anabiózy, při kterém je pohyb spermií zastaven a jejich metabolizmus je omezen na nejnižší míru. Důležité je, aby v průběhu konzervace nedošlo k poškození povrchových membrán a akrozomálního systému spermií, čímž by se porušila oplozovací schopnost spermií.
Krátkodobá konzervace. Při krátkodobé konzervaci se dosahuje stavu anabiózy především snížením teploty okolního prostředí k hranici kolem 16 C, přičemž velmi důležitou roli hraje vhodné složení ředidel. Tento způsob uchování spermatu je u inseminace prasat stále nejrozšířenější a vynakládá se velké úsilí na zkvalitnění ředidel, které umožňují uskladnění spermatu 3 dny a déle. Plodnost krátkodobě konzervovaného spermatu ovlivňují zejména tři faktory: původní kvalita spermatu, počet spermií v jedné inseminační dávce a typ ředidla.
Dlouhodobá konzervace. První zprávy v literatuře o úspěšném zabřeznutí prasnic inseminovaných zmrazeným spermatem se objevují na přelomu 40. a 50. let. V průběhu dalších desetiletí byla vyvinuta celá řada zmrazovacích a rozmrazovacích metod, z nichž největší uplatnění nalezly tzv. Beltsvillská metoda mrazení kančího spermatu v peletách a metoda mrazení v pejetách (tzv. Hülsenberg). Oba způsoby dlouhodobé konzervace předpokládají zmrazování spermatu v zahuštěné formě. Porovnání účinnosti obou metod kryokonzervace kančích spermií bylo v minulých letech předmětem intenzívního studia a uvádí se, že v kvalitě spermatu po rozmrazení, úrovni zabřezávání a plodnosti nejsou mezi oběma metodami průkazné rozdíly, které by upřednostnili praktické použití jedné z nich.
Inseminace zmrazeným kančím spermatem není v praxi tak rozšířená, jako je tomu například u skotu. Ve většině zemí je využíváno pro inseminaci čerstvé tekuté sperma a používání zmrazeného spermatu je ještě v experimentálním stupni. Odhaduje se, že ve světě je každoročně prováděno zhruba 5 až 10 miliónů prvních inseminací, ale pouze 26 000 je prováděno zmrazeným spermatem. Nízké využívání zmrazeného spermatu je především přičítáno snížení míry zabřezávání o 10 až 30 % a snížení počtu selat ve vrhu o 1 až 3 kusy v porovnání s používáním čerstvého spermatu. Navíc jsou metody kryokonzervace podstatně pracnější, nákladnější a náročnější na čas a materiálové vybavení. Jejich podstatnou nevýhodou je také minimálně dvojnásobná spotřeba spermií na jednu inseminační dávku. Z těchto důvodů je zatím používání zmrazeného kančího spermatu omezeno pouze na specializované plemenářské účely, jako je vývoz - dovoz inseminačních dávek nebo dlouhodobé uchovávaní spermatu kanců s vysokou plemennou hodnotou.
Porovnání některých v zahraničí oblíbených ředidel kančího spermatu
V polním pokusu v Nizozemí byla porovnávána tři oblíbená ředidla kančího spermatu: BTS (Beltsville Thaw Solution, ve světě jedno z nejpopulárnějších ředidel pro krátkodobé uchování spermatu), modifikovaná Modena (MM) a MR-A®. Inseminováno bylo 2896 prasnic a prasniček s jednodenním, třídenním a čtyřdenním spermatem. Výsledky z této studie jasně ukázaly, že úroveň prasení u ředidla MM byla o 18 až 50 % nižší a počet selat ve vrhu byl u téhož ředidla o 1 až 1,5 selete nižší než u ředidel BTS a MR-A® (tabulka 1). Během celé zkušební doby měla ředidla BTS a MR-A® porovnatelnou úroveň prasení, počet selat narozených celkem a živě. V této studii byly také použity dvojnásobné počty spermií v dávce (6x109 všech spermií) při čtyřtýdenní době skladování a porovnány s obvyklými počty spermií (3x109) v inseminační dávce při délce skladování 1 a 3 dny. Jak plyne z výsledků, zvýšený počet všech spermií v dávce může vyrovnat snižující se plodnost při stárnutí spermatu.
Porovnání ředidel Kiev (známého také jako Guelph, Merck I, EDTA nebo Varohm) a BTS bylo provedeno v Norsku. Data ze 2351 inseminací prasnic a prasniček (použito 2x109 pohyblivých spermií v dávce, uskladnění při 15 až 20C) ukázala zřetelný 10% úbytek úrovně prasení po 2 až 3 dnech skladování u spermatu ředěného ředidly Kiev i BTS (tabulka 2). Průměrná velikost vrhu byla o 0,5 selete vyšší se spermatem ředěným ředidlem BTS. Výsledky z této studie potvrzují očekávaný pokles plodnosti u starého spermatu a naznačují, že sperma ředěné ředidlem Kiev snižuje počet selat ve vrhu.
V jiné norské studii byly analyzovány výsledky plodnosti spermatu ředěného pomocí ředidla BTS (tabulka 3), při obsahu 2x109 všech spermií v inseminační dávce. Data zahrnovala záznamy o 15 429 inseminacích. Bylo-li sperma použito více než 48 hodin po odběru, tak nastal 50% pokles úrovně prasení. Vliv na velikost vrhu byl očividný dokonce mnohem dříve, a to již za 24 hodin, z čehož vyplývá všeobecně známý fakt, že stárnutí spermatu se projeví nejdříve poklesem velikosti vrhu a po té i úrovní prasení.
Hodnoty ve sloupcích a řádcích značené různými písmeny jsou průkazně rozdílné (P
Němečtí výzkumníci porovnali ředidla BTS a Androhep, při délce skladování spermatu 120 hodin, a nezaznamenali rozdíly mezi ředidly, pokud se týče délky doby uskladnění, pohyblivosti spermií a celistvosti akrozómu (specifický útvar na hlavičce kančích spermií). Výsledky této studie jsou uvedeny v tabulce 4.
Zajímavé porovnání s uváděnými výsledky zahraničních studií nabízí tabulka 5 a graf, ve kterých jsou uvedeny výsledky statistické analýzy aktivity spermií u kanců v České republice, získané na základě centrálně evidovaných podkladů o odběrech spermatu kanců na inseminačních stanicích v období 1990 až 1997. Z těchto výsledků vyplývá, že pokles přežitelnosti spermií u kanců v ČR je mnohem razantnější než v zahraničí a jistě by stálo za zvážení, zda tento rozpor není způsoben právě nevhodnou volbou ředidla či konzervačního postupu.
V další studii byla porovnána plodnost spermatu ředěného a uskladněného v ředidlech Kiev a Androhep (při 17 C, po dobu 5 dnů, 2,5x109 všech spermií v dávce, tabulka 6). Celkem bylo inseminováno 3100 prasnic. Průměrný počet selat ve vrhu byl o 0,6 selete nižší u spermatu ředěného ředidlem Kiev. V úrovni prasení nebyly prokázány rozdíly mezi ředidlem Kiev a Androhep, i když úroveň prasení klesla asi o 6 % během pokusu.
Posléze byla studována úroveň zabřezávání u prasniček se spermatem uskladněným po 5 dnů v ředidlech BTS nebo Androhep (při použití 2x109 všech spermií v dávce). Tabulka 7 ukazuje výsledky tohoto porovnání. Jediný zaznamenaný rozdíl v tomto pokusu byl, že ředidlo Androhep mělo vyšší úroveň zabřezávání než BTS, pokud bylo sperma starší více než 96 hodin. Obě ředidla zaznamenala stálý pokles v úrovni zabřezávání během 5 dnů, čímž se opět potvrdilo, že snížení úrovně prasení je zapříčiněno stárnutím spermií in vitro.
Tabulka 7. Porovnání ukazatelů plodnosti při použití dvou typů ředidel spermatu (Waberski et al., 1994)
V Kanadě porovnávali výsledky plodnosti čtyř ředidel kančího spermatu: BTS, MR-A®, Modena a Androhep - během čtyřdenní doby skladování. V inseminační dávce bylo 3x109 pohyblivých spermií, teplota uskladnění byla 18 C a spermatem byly inseminovány prasnice na třetím až šestém vrhu. Výzkumníci nenašli rozdíly mezi těmito čtyřmi ředidly v úrovni prasení (tabulka 8). Avšak výsledky ukázaly, že při použití ředidla Modena se po 3 až 4 dnech skladování průkazně sníží počet selat ve vrhu oproti ostatním ředidlům. Dále bylo konstatováno, že levnější ředidla (například BTS) fungují stejně dobře jako dražší dlouhodobá ředidla.
Některé důležité aspekty při ředění a konzervaci kančího spermatu
Volba ředidla by měla vycházet z požadavků inseminace a doporučuje se volit ředidlo, které vyžaduje minimální dobu a náročnost na přípravu.
U krátko a dlouhodobých ředidel lze očekávat, že celková pohyblivost a akrozomová integrita spermií budou postupně klesat úměrně s dobou skladování.
Pro třídenní dobu skladování jsou vhodná méně nákladná ředidla (např. BTS a Kiev).
Při minimalizování počtů spermií v inseminační dávce (tj. 2x109 a méně spermií) lze očekávat pokles ve velikosti vrhu, je-li ředěné sperma starší více než 24 popř. 48 hodin, tento pokles je známý zejména u ředidel Modena a Kiev.
Při používání ředěného spermatu staršího více než 72 hodin dochází k poklesu úrovně prasení o 1 až 10 %, což je způsobeno poruchami plodnosti vztahujícími se ke stáří spermatu v inkriminované době a nikoliv vlivem prasnice.
Kromě typu ředidla a délky uskladnění spermatu je plodnost ovlivněna i kvalitou neředěného spermatu, počtem spermií v dávce, manipulací, dobou inseminace a zručností techniků.
Při optimálním poměru ředění by se počet všech spermií v dávce měl pohybovat od 2 do 6 miliard. Platí obecné pravidlo, že dávka by měla zahrnovat 1 miliardu spermií pro každý den skladování (tzn. jestliže má být inseminační dávka uskladněna 2 dny, měla by obsahovat 2 miliardy všech spermií).
V České republice je podle ČSN 46 71 14 doporučován minimální objem inseminační dávky 80 cm3 a v jedné inseminační dávce by mělo být nejméně 1,5x109 aktivních spermií při krátkodobé konzervaci a 2,5x109 spermií při dlouhodobé konzervaci spermatu.
Ing. Jaroslav Smital, VÚŽV, Praha -Uhříněves
