Morfologické vyšetření spermií
Sledování a klasifikace morfologicky abnormálních spermií je neustále předmětem intenzívního výzkumu, neboť množství abnormálních spermií je důležitý ukazatel, který se bezprostředně promítá do efektivity inseminace.
Vizuální popis morfologické stavby kančích spermií umožňuje posoudit vývojové a zrací aspekty buňky spermie. Jestliže se vyskytne velké množství morfologicky abnormálních spermií v ejakulátu (příznak špatné spermiogeneze nebo špatného zrání spermií, popřípadě nevhodné manipulace), znamená to, že kvalita zbývajících, i normálně se jevících spermií je zpochybněna, jelikož spermie přítomné v daném ejakulátě podstupují spermiogenezi, zrání i manipulaci v přibližně stejné době. Tuto úvahu dokládají i publikovaná pozorování toho, že ejakuláty s nadměrnou mírou morfologicky abnormálních spermií nemají schopnost oplodnit ovocyty.
Základní metodou morfologického vyšetření spermií je subjektivní vizuální popis pomocí mikroskopu. Vytvoří se suché obarvené sklíčko se stejným objemem (asi 10 l) barviva a vzorku spermatu a hodnotí se minimálně 100 (raději 200) polí. Doporučuje se zařazovat spermie alespoň do přibližných kategorií: normální spermie, spermie s abnormálními hlavičkami a spermie s abnormálními bičíky.
Morfologické změny spermií lze rozdělit podle příčiny jejich vzniku na primární a sekundární. Primární jsou ty změny, které vznikají v průběhu procesu spermiogeneze, zatímco za sekundární jsou považovány takové změny, které vznikají již na zformované spermii, tedy v průběhu pasáže spermií vývodními pohlavními cestami nebo během celého zpracování spermatu po jeho získání. V literatuře se uvádí, že charakteristickými morfologickými odchylkami spermií u neplodných kanců jsou proximální protoplazmatická kapka (42 %), tvarový defekt akrozómu (18 %), protoplazmatická kapka na spojovací části bičíku (17 %), smyčka na bičíku (9 %) a perzistující akroblast (5 %). Zbývající defekty lze považovat za zcela netypické změny spermií ve spermatu neplodných kanců. Morfologickou odchylkou charakterizující spermie i plodných kanců je především protoplazmatická kapka na spojovací části bičíku (4 %). Ostatní morfologické změny z hlediska normální neporušené plodnosti je možné považovat za fyziologické hladiny výskytu.
Součástí morfologického vyšetření by mělo být i posouzení morfologické stavby akrozomu. Kančí spermie mají, na rozdíl od jiných domestikovaných druhů, velmi velkou hlavičku a nápadný akrozom (také popisován jako akrozomový hrbol), který je lehce viditelný mikroskopem. Akrozom hraje primární roli při připojení spermie k zóně pelucidě ovocytu a tudíž se jeho poškození často zjistí, až když má za následek snížení plodnosti.
Funkční způsobilost spermií
Pro život buňky jsou nezbytné neporušené buněčné membrány. Odhady pouhé pohyblivosti spermií nemusí poskytovat spolehlivou informaci o životaschopnosti buněk, jelikož nelze rozeznat buňky, které jsou ještě ve stavu anabiozy.
Barvící a značkovací techniky
Ke stanovení integrity buněčných membrán byly vyvinuty různé barvící techniky. U kančího spermatu se dříve používaná barviva (jako například eozínová zeleň a různé kombinace eozín-nigrosin) ukázala jako nespolehlivá při detekci membránových poškození a mrtvých buněk; dokonce při určité koncentraci byla spermicidní a mohla vést i ke zvýšenému počtu artefaktů. Proto se používá ověřená barvící technika, založená na 2% roztoku "trypanové" modři v TCM 199 (kultivační prostředí pro buňky). Tato technika spočívá ve smíchání stejných částí barviva se vzorkem spermatu s následnou inkubací ve 37 C po 15 minut. U vysušeného vzorku se pak stanoví procento mrtvých (modrých) spermiových buněk.
Další technika, která byla zkoušena pro odhad životaschopnosti buňky, využívá fluoroformních složek, jako je například Calcein acetyl-methyl ester (CAM) a Ethidium homodimer (EH), a epifluorescenční mikroskopii. Ve svém přirozeném stavu není CAM fluorescenční díky acetyl-methyl esterové vazbě a směs je navíc lipofilní a tak schopná projít membránou. V přítomnosti vnitrobuněčných esteras spermie je acetyl-methyl ester enzymaticky štěpen, vytváří se membránou nepropustné molekuly Calceinu (CA). Když je CA excitován prostřednictvím fluorescenčního světla způsobí, že živé spermie s neporušenou membránou vyzařují intenzívní zelenou barvu. Oproti tomu, živé buňky jsou normálně nepropustné pro EH, kvůli jeho silnému kladnému náboji a poměrně velké velikosti. Proto EH může pouze obarvit spermiové buňky s poškozenou membránou. Když je EH excitován, mrtvé spermie svítí červenou barvou.
Test hypoosmotické bobtnavosti
K hodnocení funkční integrity spermií lze též použít test hypoosmotické bobtnavosti (HOS). Test byl zpočátku aplikován v humánní medicíně, teprve nedávno byl přizpůsoben i pro některé druhy domestifikovaných zvířat. HOS test spočívá na fyziologickém principu selektivní propustnosti buněčné membrány. Jestliže je neporušená buňka vystavena okolnímu hypoosmotickému prostředí, tak vyšší hustota roztoku v buňce způsobí pasívní tok vody z vnějšího hypotonického prostředí do buňky, až se dosáhne osmotické rovnováhy. Vtok vody má za následek bobtnání buňky. U spermiové buňky se toto bobtnání vyskytuje nejdříve na bičíku, v oblasti s největší plochou povrchu. Když se bičík zvětšuje, kadeří se, což je zřetelně rozeznatelné pod mikroskopem. Jestliže je membrána buňky porušená nebo nefunkční (poškozená nebo mrtvá spermie) bobtnání nenastane, tudíž tento jev může být dáván do vztahu pouze s funkční plazmatickou membránou spermie. HOS test je jednoduchý, levný a rychlý. Přibližně 0,1 ml ejakulátu je smícháno s 1,0 ml hypoosmotického roztoku a vzorek je inkubován po 30 minut při 37 C a posléze je mikroskopicky stanoveno procento spermií s nabobtnanými bičíky. Funkční integrita spermiových membrán, odhadnutá HOS testem těsně koreluje s výsledky testů penetrace spermií oocytů křečků, zbavených zony pellucidy, ale někteří odborníci vyjadřují výhrady k významu tohoto testu při prognóze plodnosti.
Test osmotické rezistence
Test osmotické rezistence (ORT) je modifikovaný HOS test, který speciálně zkoumá akrozom. ORT se provádí vložením čerstvého spermatu do izotonického a hypotonického prostředí. Izotonické a hypotonické vzorky jsou inkubovány rozličnou dobu, a procento normálních akrozomů v každém vzorku je stanovené pomocí mikroskopu. Jelikož výsledky o spolehlivosti ORT testu jsou zatím nedostatečné, je používání tohoto testu jako součásti rutinní analýzy spermatu momentálně problematické.
Resazurinový test
V humánní medicíně byl vyvinutý in vitro kolorimetrický test k určení životaschopné koncentrace spermií. Zkouška používá resazurin, modré barvivo, které je metabolizováno živými buňkami. V průběhu procesu a v závislosti na čase a koncentraci barviva, modrý resazurin je postupně redukován na bílý metabolit, čímž je umožněna vizuální detekce životaschopné buňky. Čas požadovaný na změnu barvy (tj. z modré na bílou) může být použit k výpočtu koncentrace životaschopných spermií v 1 ml neředěného spermatu, a ke stanovení vhodného poměru ředění a počtu dávek spermatu.Tato metoda byla vyzkoušena na ejakulátech různých domestikovaných zvířat a je běžně prodejná. Souprava se snadnou manipulací je kalibrovaná tak, že změna barvy nastane při minimální koncentraci 1x108/ml životaschopných spermií v neředěném kančím spermatu. Test může být prospěšný pro chovatele kanců, jenž nemají takové základní vybavení, jako je mikroskop a fotometr.
Odhady pohyblivosti, koncentrace, životaschopnosti a morfologické stavby spermií lze provádět i pomocí dalších metod, jako je například zkouška bioluminescence (světélkování), počítačový videografický rozbor buňky, elektronová mikroskopie, počítadlo Coulter, proudová cytometrie a fluorometrická měření. Dále byly zkoušeny i biochemické rozbory spermií a semenné plazmy jako doplněk testů pro určování kvality spermatu. Avšak kvůli vysokým nákladům a náročnosti těchto technik, jsou v současné době použitelné jen ve výzkumu.
Heterospermie
Při používání inseminace heterospermiemi (tj. smíchané sperma od dvou čí více plemeníků) byl pozorován zajímavý jev, poměr zplozeného potomstva lze ovlivňovat poměrem spermií v dávce. Je-li poměr spermií například 50:50 a poměr následného potomstva je 80:20, může být poměr potomstva převeden na 50:50 regulováním poměru spermií na 20:80. To dokazuje, že rozdíly v plodnosti mezi kanci jsou perzistentní a pravděpodobně vrozené, a uvedený jev lze využít k přesnějšímu posouzení těchto rozdílů. Bylo odhadnuto, že heterospermie je 170x citlivější při hodnocení rozdílů mezi samci než jiné metody. Jelikož heterospermie je soutěž mezi spermiemi v jedné časoprostorové události (vše se odehrává v jedné samici či misce), má každá spermie teoreticky stejnou šanci oplodnit vajíčko, bez ohledu na vliv prasnice, techniku inseminace či sezónu a případné rozdíly v plodnosti tak mohou být jednoznačně přiřazeny vlivu kance.
K tomu, aby se heterospermie mohla používat jako rutinní metoda pro hodnocení plodnosti kanců, je však třeba ještě dořešit vhodný objektivní in vitro test, který by napodoboval podmínky oplození, a umožňoval by za standardních regulovaných podmínek porovnávat různé populace označených kančích spermií (podrobněji viz Náš chov, 1998, 11, str. 25 - 26).
Souhrn
Kanci se liší v plodnosti především díky genetickému založení a proto je detekce těchto rozdílů pro chovatele velmi důležitá, neboť dopad samce na reprodukční užitkovost stáda je vysoký.
Sledované ukazatele plodnosti kanců se člení na primární (velikost a hmotnost vrhu, míra zabřezávání) a sekundární (pohlavní orgány, libido sexualis, kvalita spermatu a ukazatele biomolekulárních analýz).
Pro posuzování libida existují tři základní postupy: stupnice známek na základě chování samce k říjné samici, měření doby potřebné k první ejakulaci od přivedení samce k samici nebo fantomu a hodnocení výkonu samce za určitou časovou jednotku pomocí vyčerpávajícího testu.
Pro klinické hodnocení kančích spermií a kvality spermatu je k dispozici mnoho testů, které byly vyvinuté k měření specifických vlastností nepostradatelných pro plodnost. Samy o sobě mají tyto testy omezenou informační hodnotu pro celkovou predikci plodnosti, mohou alespoň vyloučit ejakuláty zjevně špatné kvality.
Odhaduje se, že heterospermie je 170x citlivější při hodnocení rozdílů mezi samci než jiné metody a jelikož je soutěží mezi spermiemi v jedné časoprostorové události, má každá spermie teoreticky stejnou šanci oplodnit vajíčko bez ohledu na vliv prasnice, techniku inseminace či sezónu a případné rozdíly v plodnosti tak mohou být jednoznačně přiřazeny vlivu kance.
Kontrola kvality spermatu pro inseminaci je prvním krokem k dosažení požadované úrovně plodnosti v chovu prasat. V publikacích jsou doporučovány minimální hodnoty pro kritéria neředěného kančího spermatu používaného pro inseminaci (tabulka). Tyto základní hodnoty se mohou upravovat na základě shromážděných a analyzovaných dat, ale měly by je provádět inseminační centra s nezbytným vybavením.
Ing. Jaroslav Smital, Ing. Lourenco Lino De Sousa, PhD.
Výzkumný ústav živočišné výroby, Praha -Uhříněves
