Možnost volby pohlaví dosud nenarozeného potomka patří dlouhá léta mezi „vysněné“ reprodukční technologie. Tato schopnost je v rozporu s přírodními zákonitostmi, podle kterých je pohlaví potomků determinováno náhodně, zhruba se stejnou pravděpodobností u obou pohlaví. Z hlediska individuálního (příp. hlediska páru) je však v některých případech pohlaví potomka otázkou velmi významnou a důležitou.
Srovnáme-li situaci v r. 2000 se situací před 50-100 lety, musíme konstatovat výrazný posun v pohledu na význam určování pohlaví potomstva. Patrně největší význam by měla aplikace této metody v programu zaměřeném na cílenou redukci výskytu genetických poruch vázaných na pohlaví v lidské populaci. Existuje více než 500 známých poruch vázaných na výskyt chromozómu X. Ve většině případů polovina synů narozených matkám, které jsou nositelkami genetické poruchy vázané na tento chromozóm, je postižena, zatímco u dcer narozených těmto matkám se porucha nevyskytuje. Volba pohlaví dítěte by tak výrazně zvýšila šance rodičovského páru mít zdravé dítě – dceru. Poněkud kontroverznější je další případné využití této metody za účelem „vyrovnání“ poměru pohlaví v rodině. V kontextu s někdy oprávněnou potřebou redukce nárůstu populace nežádoucím směrem by však mohla tato metoda mít také své opodstatnění.
Uvedená metoda je stejně významná a perspektivní i v případě chovu zvířat. Ve vyspělých zemích se v uplynulém století dramaticky změnily metody chovu. Sexování by významně ovlivnilo především efektivnost systémů šlechtění zaměřených na zlepšování produkčních parametrů vázaných na pohlaví. V současné době žije na světě přes 6 biliónů lidí; v průběhu posledních 30 let se tedy počet obyvatel naší planety zdvojnásobil. Požadavky na skutečně efektivní produkci živočišných produktů budou tedy bezpochyby neustále vysoce aktuální.
Rok 2000 je oproti roku 1900 charakterizován dalším závažným problémem: záchranou ohrožených druhů zvířat. V tomto případě se sice uplatňuje vcelku úspěšně asistovaná reprodukce – vzhledem ke skutečnosti, že v řadě případů je však k dispozici již jen velmi malý počet žijících a reprodukčně využitelných zvířat, bylo by uplatnění metody sexování velmi prospěšné a užitečné (i se zřetelem k možné redukci inbrídinku na minimum). Nelze opomenout ani „módní“ trend, se kterým se setkáváme stále častěji: řada lidí vydává přímo či nepřímo nemalé finanční částky na chov „neprodukčních“ (ekonomicky neefektivních) zvířat (např. chov koní). Z ekonomických důvodů se potom např. preferuje produkce klisen pony používaných pro pólo. Uvedené příklady nelze samozřejmě aplikovat na všechny země a všechny typy kultur. Ilustrují však dostatečně skutečnost, že význam volby pohlaví v době koncepce neustále narůstá a je proto nezbytné se tomuto úkolu systematicky a intenzívně věnovat.
Určení pohlaví nenarozeného potomstva pomocí ultrazvuku
Existuje pochopitelně řada způsobů, které se snaží tuto problematiku uspokojivě vyřešit. U mnoho druhů zvířat i u lidí lze využít ke stanovení pohlaví plodu relativně neinvazivní ultrazvukovou metodu. Tato metoda má však řadu omezení: např. u skotu je období do 2 měsíců březosti nepřesná a po 3 měsících březosti obtížně použitelná vzhledem k poloze plodu. Dále: pohlaví plodu je sice určeno, ale nikoliv zvoleno. Přesto je tato informace důležitá a dobře využitelná; z toho důvodu je tato služba často vyžadována
Sexování embryí (určování pohlaví embryí)
Pohlaví embryí dosud neimplantovaných lze rovněž stanovit poměrně přesně řadou postupů. Podobně jako v předchozím případě jde však spíše o identifikaci než o volbu pohlaví. Vyřazení nežádoucích embryí není však příliš nákladné a může být proto využito k různému účelu, např. k přerušení gravidity v případě genetické poruchy vázané na pohlaví nebo nechtěného nežádoucího pohlaví potomka.
Vliv doby kopulace nebo inseminace na směr pohlaví potomstva
Značně odlišný způsob regulace poměru pohlaví reprezentuje načasování doby kopulace nebo inseminace k ovulaci. Tyto „lidové“ metody neměly nikdy velkou šanci na úspěch už vzhledem k tomu, že nejsou běžně k dispozici prostředky pro časové vymezení doby ovulace. Nedávné experimenty využívající přesnější technologické kontroly reprodukčního cyklu demonstrovaly jistou omezenou možnost ovlivnění poměru pohlaví u některých druhů zvířat „načasováním“ doby inseminace – výsledky však nejsou průkazné. Podobným fenoménem je zřejmá schopnost samic některých druhů savců regulovat do určité míry poměr pohlaví potomstva podle podmínek prostředí. Změny v poměru pohlaví způsobené fyziologickými podmínkami nebo podmínkami prostředí by mohly mít značný ekonomický význam pro chovatele hospodářských zvířat. Velmi rozdílné výsledky publikované v odborné literatuře i významné diference mezi jednotlivými druhy zvířat však prozatím znemožňují využití uvedených faktorů při ovlivňování poměru pohlaví potomstva. Z fyziologického hlediska by se dal poměr pohlaví ovlivnit usnadněním případně zamezením transportu spermií s chromozómem X nebo spermií s chromozómem Y reprodukčním traktem. Značná pozornost je věnována metodě, která využívá načasování doby zapuštění nebo inseminace – tímto způsobem lze využít in vivo podmínek zvýhodňujících spermie s chromozómem X nebo chromozómem Y. Řada studií provedených u různých druhů savců naznačila, že toto načasování doby zapuštění nebo inseminace ve vztahu k době ovulace může ovlivnit poměr pohlaví potomstva.
U většiny druhů zvířat se časný termín inseminace nebo zapuštění projevuje vyšším podílem samičího potomstva; pozdní termín potom spíše vyšším podílem samčího potomstva. U skotu byl tento jev sledován již před mnoha lety. Už v r. 1895 byly uvedeny první výsledky dokumentující uvedený trend. V průběhu cca 100 let však nebyly tyto předpoklady dostatečně prokázány. Např. výsledky studií z posledních let neukázaly naprosto žádný významnější rozdíl v poměru pohlaví potomstva narozeného po inseminaci provedené v časné nebo pozdní fázi říje. Výsledky podobných studií jsou samozřejmě značně ovlivněny přesností stanovení fáze říje, a tím i klasifikace doby inseminace nebo zapuštění. Na rozdíl od minulosti jsou však v současné době již k dispozici poměrně spolehlivé metody, kterými lze uvedený nedostatek překonat – např. sledování rezistence vaginálního případně cervikálního sektoru, která je závislá na koncentraci pohlavních hormonů.
Poměr pohlaví lze ovlivnit také metodou užitou k synchronizaci říje před inseminací – např. aplikace PGF 2alfa by měla upřednostnit vývoj samčího potomstva ( v důsledku redukce hladiny progesteronu), zatímco aplikace PGF 2alfa v kombinaci s GnRH má patrně opačný účinek (v důsledku zvýšené koncentrace gonadotropinu). Tyto předpoklady je však třeba prověřit dalšími experimenty. V případě inseminací provedených 8, 16 a 24 hodin po aplikaci GnRH dojnicím nebyly zjištěny významné rozdíly ve vztahu k očekávanému poměru pohlaví. Nedávno bylo prokázáno různé tempo vývoje samčích a samičích embryí za určitých podmínek in vitro; bylo by tedy možné pokusit se o možnost volby pohlaví tímto způsobem.
Byla prokázána odlišná schopnost oocytů produkovat samčí a samičí embrya v závislosti na zralosti oocytu. Např. v případě inseminace bivinních oocytů po 16 hodinách zrání in vitro byl zjištěn poměr samčích a samičích 2-buněčných embryí 0,5:1; v případě posunutí doby inseminace o 8 hod. později byl zjištěn poměr 2,2:1. Další podobná studie srovnávající oocyty zrající in vitro 16 a 24 hodin uvedené výsledky potvrdila (0,61:1 a 1,67:1).
Rovněž u ovcí byl pozorován možný in vivo vliv stádia oocytu na poměr pohlaví. V souboru 380 bahnic inseminovaných v různých intervalech před ovulací a po ovulaci byl např. u ovcí inseminovaných v průběhu 5 hodin před ovulací zjištěn 60%-ní podíl samičího potomstva. Naopak u bahnic inseminovaných v průběhu 5 hodin po ovulaci byl zjištěn 75%-ní podíl samčího potomstva.
Vzhledem ke skutečnosti, že dosavadní výsledky nejsou dostatečně přesvědčivé a spolehlivé, je jejich eventuální přínos prozatím minimálně diskutabilní a málo významný.
Sexace spermií
V popředí zájmu výzkumu však bezesporu stojí separace spermií s chromozómem X a chromozómem Y. V průběhu let byla vyzkoušena řada postupů založených na prokázaných, případně předpokládaných rozdílech ve fyzikálních vlastnostech nebo imunologických faktorech.
Především imunologické metody jsou velmi atraktivní, poněvadž dávají předpoklady pro uplatnění nenákladných a nenáročných postupů. Konvenční postup imunologického sexování – užití povrchového proteinu – se prozatím nejeví jako perspektivní a nadějný. Odlišení spermií s chromozómem X a chromozómem Y na bázi objemové diference je také často prezentován jako potenciální způsob separace; efektivnost uvedených metod však stále nebyla stanovena, poněvadž tyto metody nebyly doposud testovány v praktických podmínkách.
Základem jediného efektivního způsobu separace, který je v současné době k dispozici, je diference v obsahu DNA. Separace spermií metodou průtokové cytometrie je nyní tak rozpracovaná, že momentálně není důležitá otázka, zda a jak dobře funguje, ale jak bychom mohli využít nových technologických postupů vysokorychlostního třídění buněk k tomu, abychom produkovali větší množství životaschopných spermií typu X a Y za časovou jednotku. Čím vyšší bude produkce sexovaných spermií za časovou jednotku, tím rozsáhlejší bude aplikace metody (u zvířat i u lidí) při nízkých nákladech. Sebevětší technologický pokrok však neeliminuje fundamentální nevýhody tohoto způsobu třídění spermií a nutnost přidávat k suspenzi barvivo potřebné k detekci diferencí DNA. I přes uvedené nedostatky je však aplikace této metody u zvířat i lidí garantována.
Pokrok v technologii předvolby pohlaví na bázi obsahu DNA nebyl závislý pouze na použité metodě separace, ale také na aplikaci účinné laboratorní metody využitelné pro zhodnocení a kontrolu získaných populací separovaných spermií s chromozómem X a chromozómem Y. Před r. 1982 nebyla v podstatě k dispozici žádná praktická laboratorní metoda, kterou by bylo možno zjistit, zda a do jaké míry byla jakákoliv metoda separace úspěšná; jediným možným způsobem kontroly byla inseminace a následné stanovení plodů nebo narozených potomků. V současné době máme k dispozici několik skutečně spolehlivých metod pro potvrzení pohlaví přímo u spermií – např. opakovanou analýzu obsahu DNA průtokovou cytometrií, metodu FISH (fluorescence in situ hybridization), využití polymerázové řetězové reakce (PCR metody) apod.
Velká pozornost je věnována vývoji postupů, jejichž pomocí může být dosaženo koncepce redukovaným počtem spermií. Tříděním spermií metodou průtokové cytometrie se získává omezené množství spermií – tento nedostatek lze překlenout použitím metody IVF (in vitro produkce embryí) nebo injekcí spermií přímo do oocytu; pokud jde ovšem o umělou inseminaci, laparoskopické nebo chirurgické metody oplození, jedná se o vážný problém, který je třeba technicky a přístrojově uspokojivě vyřešit.
V určitých ohledech je stanovení pohlaví v době koncepce triviální v porovnání se složitějšími a náročnějšími technologiemi jakými jsou např. genové manipulace. Ale právě tato jednoduchost je činí atraktivními. Často se setkáváme s názorem, že metoda klonování nahradí sexování spermií podobně jako sexování spermií nahradí sexování embryí. Je bezpochyby jisté, že v budoucnu nastane doba, kdy uvedené technologie do určité míry nahradí jedna druhou. Uplatnění dané technologie na trhu však bude zcela jistě závislé především na cenových relacích, efektivnosti, použitelnosti metody, na prostupnosti trhu a odstranění obchodních překážek, ale také na veřejném mínění apod.
Klonování a další biotechnologie
Metoda klonování využívající přenos nukleí umožňuje provádět přímou selekci pohlaví – její účinnost je však momentálně extrémně nízká (i když se rapidně zvyšuje); často jsou zjišťovány abnormality jak u gravidních zvířat, tak u narozených jedinců. Přestože by snad bylo možné v brzké době některé z těchto potíží odstranit, je reálná hodnota metody klonování ve vztahu k jejímu uplatnění v živočišné výrobě často přeceňována. S výjimkou parametrů charakterizovaných vysokou heritabilitou je použitelnost metody klonování výrazně omezována nejen obtížnou identifikací zvířat se skutečně výjimečnou genetickou hodnotou, ale i nízkou opakovatelností produkčních parametrů. Z toho samozřejmě nelze usuzovat, že by klonování nebylo výjimečně významným nástrojem selekce, ovšem ve vztahu k zemědělské praxi mohou být přednosti této metody méně významné, než by se na první pohled zdálo a náklady na uplatnění metody v široké praxi by nemohly být o mnoho vyšší než náklady na rutinní využití AI (umělé inseminace). Totéž platí v podstatě i pro další metody: genové manipulace a produkci transgenních zvířat, sexování spermií a další technologické postupy – široké uplatnění těchto bezpochyby progresivních metod musí být dostatečně efektivní, spolehlivé, nenáročné a cenově přijatelné. Využívání metody sexování spermií je také omezeno skutečností, že k produkci finálního produktu musí být použity i další technologické postupy: AI, případně IVF v kombinaci s ET.
Metodu sexování spermií lze v současné době s úspěchem využívat pro experimentální účely, případně pro některé další speciální aplikace např. v oblasti humánní medicíny. Pro uplatnění v široké praxi ne naprosto nezbytné snížit náklady a zvýšit účinnost a spolehlivost metody. Aplikovatelnost metody je také závislá na řadě dalších důležitých okolností (vývoj dokonalejších zařízení na třídění a separaci buněk, pokroku v imunologii apod.).
Doc. ing. Jan Říha, DrSc.
VÚCHS, s.r.o., Rapotín
