Bacily obecně
Součástí celkové mikroflóry mléka jsou sporotvorné mikroorganismy, které jsou však těžko detekovatelné za použití kultivačních metod pro stanovení hlavního hygienického ukazatele CPM (celkový počet mikroorganismů). Mezi sledované skupiny těchto mikroorganismů řadíme rod Bacillus a Clostridium. Jejich společnou vlastností je, že mohou přežívat nepříznivé podmínky pro jejich růst i několik let v podobě spór, které jsou velmi odolné vůči extrémním teplotám. Baktérie rodu Bacillus jsou grampozitivní bičíkaté tyčky, tvořící endospóry a rostoucí za aerobních až fakultativně anaerobních podmínek.
Většina z nich roste při teplotě kolem 30 až 37 oC (B. cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus sporothermodurans, B. subtilis, B pumilus, B. luteus, B. lentus, B. fusiformis, B. badius, B. sphaericus, Paenobacillus pabuli, P. glukanolyticus a další), ale jsou tu i zástupci termotolerantních 45 až 55 oC (B. stearothermophilus, B. licheniformis, B. badius a další) a psychrotrofních organismů 4 až 6,5 oC (Bacillus weihenstephanensis). V současné době je zaměřen zájem na výskyt baktérií rodu Bacillus, konkrétněji Bacillus cereus. Při jeho značném pomnožení (107 CFU/ml) může docházet ke zdravotním potížím. Objeví se příznaky průjmu a zvracení. Avšak vzhledem k tomu, že se taxonomie baktérií vyvíjí a doplňuje nejen po objevení zcela nového druhu, ale rovněž při rozlišení některých vlastností již druhu známého nebo při objevení jejich zcela nových vlastností, rozšiřuje se okruh zájmů i na tyto druhy. Bacillus weihenstephanensis byl dříve označován společně jako B. cereus. Od mateřského kmene jej oddělila schopnost růstu při nižší teplotě 4 až 6,5 oC a v roce 1998 byl tento kmen zařazen do samostatného druhu. U kmene Bacillus licheniformis je známa jeho schopnost tvořit diarrhoealní toxin nebo rovněž přežít nejen vysoké pasterační, ale i UHT teploty. Některé bacily Bacillus sporothermodurans tvoří skupinu nepatogenních, růstově náročných bacilů, se spórami značně rezistentními k vysokým teplotám (HHRS). Bacily jsou většinou schopné tvorby proteolytických a lipolytických termostabilních enzymů, které opět mohou při vysoké koncentraci znehodnotit mléko jako surovinu nebo meziprodukt.
Patogenita bacilů
Do roku 1930, kdy byla konečně objevena účinná vakcína, byl velmi obávaným patogenem B. anthracis. Způsoboval fatální onemocnění anthrax přenášené z nemocného zvířete na člověka a posléze z nemocného člověka na člověka. Dnes se tato nebezpečná choroba vyskytuje pouze v ojedinělých případech v zemích, kde dosud nefunguje státní veterinární dohled. Vývoz zvířat z těchto zemí, které jsou evidované, je přísně zakázán. Většina průjmových onemocnění z potravin je připisována dalšímu důležitému potravnímu patogenu B. cereus, který se projevuje dvěma syndromy potravinových otrav. Diarrhoeální typ způsobuje tvorbou termolabilního enterotoxinového komplexu průjem a bolesti v břiše po 8 až 16 hodinách po požití kontaminované potravy (mléko). Emetický typ je charakterizován tvorbou termostabilního enterotoxinu a vyvolává žaludeční nevolnost a zvracení po 1 až 5 hodinách (pasterizovaná smetana, mléčný pudink). Podobnými vlastnostmi se vyznačuje B. weihenstephanensis, rostoucí při nízké teplotě. B. cereus je také virulentní a oční patogen, naštěstí s velmi vzácným výskytem. B. licheniformis může být příčinou průjmových onemocnění, B. subtilis může vyvolávat onemocnění z potravin a je spojován i s bovinní mastitidou. B. pumilus byl nalezen v případech vředového onemocnění nebo hemoroidů, je rovněž spojován s bovinní mastitidou. Bacillus sphaericus byl zjištěn u fatálního plicního pseudotumoru a meningitidě. Z ostatních druhů, můžeme uvést B. brevis (nyní přejmenován na Brevibacillus agri), který byl izolován ve spojitosti s onemocněním z vody (zvracení) ve Švédsku, kmeny B. thuringiensis a B. mycoides mohou také produkovat diarrhoeální toxin.
Bacily v syrovém mléce
V prvovýrobě se bacily nacházejí hlavně v prostředí hnoje, podestýlky, siláže, půdy, vody apod. Do bazénového mléka se dostávají přes dojicí techniku a sporulují. Do vegetativní formy se dostávají za různých podmínek vyvolaných tlakem, teplotou, v našem případě pasterací, a množí se. Z druhů, které se nám podařilo izolovat v syrovém kravském mléce, to jsou B. cereus, B. licheniformis, B. subtilis, B. weihenstephanensis, B. pumilus, B. luteus, B. lentus, B. fusiformis, B. badius, B. sphaericus, Paenobacillus pabuli, P. glukanolyticus (tab. 1). Vzorky mléka se nejdříve zahřívají na 85 oC po dobu 10 minut, aby spóry přecházely do vegetativní podoby. Kultivace jednotlivých druhů bacilů probíhá podle jejich růstových podmínek (Havlová, 1993, Lechner a kol., Phillips, 1986, Petterson a kol., 1996).
Bacily ve výrobním procesu a finálním výrobku
Do finálního výrobku mohou pronikat baktérie již z prvovýroby nebo v průběhu technologického zpracování mléka. Důkaz o jejich výskytu lze zjistit až cíleným rozborem. Ve spolupráci s mlékárnou jsme odebrali fázové vzorky mléka jedné šarže (tab. 2). Kultivace syrového, pasterovaného a UHT mléka probíhala za stejných podmínek jako mléko syrové. V průběhu celého pokusu se nám podařilo izolovat a identifikovat B. cereus, B. licheniformis a B. subtilis. Nejčetnější zastoupení i v pasterovaném a UHT mléku měl B. licheniformis (tab. 3). Vyskytoval se v celém průběhu výroba – uchování – pasterace - finální výrobek (UHT mléko). Přežívá lépe pasteraci, protože jeho druhy jsou termotolerantní a rostou při vyšší teplotě (55 oC). Vzhledem k jeho četnosti výskytu se dá předpokládat jeho průnik z prvovýroby. B. cereus se nám podařilo izolovat v syrovém mléce v tanku, později pak v pasterovaném a UHT mléce. Jeho původ nelze již jednoznačně vysvětlit, neboť se nevyskytoval v celém průběhu fázového pokusu. Může buď pocházet z prvovýroby, nebo byl zničen pasterací a mléko bylo rekontaminováno v dalším průběhu zpracování. Tyto otázky lze definitivně vyřešit jedině za použití níže uvedených metod.
Existuje rychlá a přesná metoda identifikace a určení původu baktérií?
V současné době existují nejpřesnější metody identifikace a identity na molekulární úrovni (tzv. fingerprinting = otisk prstu). Použitím těchto metod je možné zjistit průnik konkrétního mikroorganismu v potravinovém řetězci a přesně určit nejen jeho druh, ale i původ. Tyto metody jsou zatím velmi nákladné a některé zdlouhavé a disponují jimi pouze určitá pracoviště. Pro představu cena za určení 18 kmenů pomocí metody ribotyping se pohybuje kolem 20 000 Kč a minimální doba stanovení je 5 dnů.. Vedle toho existuje tzv. automatizovaný ribotyping, který je schopen provést identifikaci baktérií během 8 hodin. V naší republice dosud není odzkoušena, neboť pořizovací cena automatizovaného přístroje převyšuje částku milión dolarů. Na druhou stranu výsledky těchto metod mohou být velmi efektivně využity v jakémkoliv výrobním procesu, spojené s potravinami, popřípadě i v klinické mikrobiologii. Laicky řečeno je možné s určitostí říci, zda v našem případě potravní patogen pochází z prvovýroby (syrové mléko) nebo je výrobek kontaminován v následném zpracování. Pomocí metody ribotypizace jsme se pokusili dostat odpověď na naši otázku. Konečné zpracování výsledků (tzv. dendrogramy) ukazují v našem případě na 85 až 93% shodu identity kmenů B. cereus a 70 až 100% shodu B. lichniformis jak v syrovém, tak v pasterovaném a UHT mléku, a tím můžeme odhadovat na původ kontaminace již z prvovýroby. Tento verdikt ale nemůže být brán jako dogma pro jakýkoliv výskyt těchto patogenů. Do budoucna však mohou sloužit metody založené na molekulární analýze k vyřešení sporů původu kontaminace, popřípadě ke zvýšení efektivnosti HACCP v prvovýrobě nebo v technologickém procesu.
Řešeno pomocí výzkumného úkolu MZe ČR, ev. č. EP9058, Národní agentura pro zemědělský výzkum
Marcela Vyletělová, Výzkumný ústav pro chov skotu, Rapotín
