Pro účel záchrany ohrožených populací ovcí může kryokonzervace epididymálních spermatických buněk představovat naprosto zásadní způsob pro bezpečné uchování genofondu. Podobně jako u mrazení ejakulátu je mrazení epididymálních spermatických buněk náchylné na poškození v průběhu kryokonzervace. Testování ředidel s kryoprotektivními účinky je zásadním optimalizačním postupem procesu. Pro studii bylo využito šest pohlavně dospělých beranů valašské ovce porážených na jatkách nebo domácích porážkáh přímo u vybraných chovatelů plemene. V průběhu porážky byl od beranů odejmut šourek s varlaty, ze kterých byly v laboratoři katedry chovu hospodářských zvířat ČZU v Praze izolovány epididymální spermatické buňky.
Epididymální spermatické buňky byly ředěny variantami 1. AndroMed® (Minitübe GmbH, Tiefenbach, Germany); 2. OptiXcell® (IMV Technologies, L ́Aigle, Francie); 3. kombinace ředidel AndroMed® a OptiXcell® (1:1). Následně byly inseminační dávky mrazeny v tekutém dusíku. Po rozmrazení byly sledovány pohybové ukazatele buněk (celková a progresivní pohyblivost), životaschopnost buněk a mitochondriální aktivita okamžitě po rozmrazení a po dvou hodinách tepelného testu přežitelnosti. Jak samostatné ředidlo OptiXcell® tak směs ředidel OptiXcell® a AndroMed® dosahovaly statisticky průkazně vyšších hodnot oproti samostatnému ředidlu AndroMed® ve většině sledovaných charakteristik. Toto zjištění představuje zásadní optimalizační krok při kryokonzervaci epididymálních spermatických buněk. Izolace a kryokonzervace epididymálních spermatických buněk z nadvarlat poražených či uhynulých beranů tedy může představovat zajímavý a důležitý nástroj při uchování genetický ohrožených populací.
Inseminační dávky uchovávané v kapalném dusíku představují základní nástroj pro uchování geneticky cenných plemeníků. Za využití umělé inseminace se inseminačními dávkami vybraných plemeníků podařilo zvýšit užitkové vlastnosti, zlepšit přesnost odhadů plemenných hodnot a dosáhnout tak intenzivnějšího genetického pokroku v populaci. Mrazené inseminační dávky zároveň představují bezpečný způsob uchování daných plemeníků. Z tohoto důvodu tvoří důležitou součást in vitro záchranného programu ohrožených populací hospodářských zvířat.
Pro specifické účely jsou však v nejhlubším zájmu také epididydimální spermie izolované z nadvarlat uhynulých nebo poražených jedinců (post mortem). Za určitých podmínek mohou takto izolované spermie představovat nenahraditelný zdroj genetických informací pro populaci daných plemen. Získávání epididymálních spermií je využívanou alternativou u zvířat v případech, kdy klasická technika odběru nepřichází v úvahu. Cílem předložené práce tudíž bylo srovnat výchozí ředidla a jejich směs v definovaném poměru na pohybové charakteristiky a poškození buněčných organel u beranů plemene valašské ovce.
Pro účel izolace epididymálních spermatických buněk bylo využito šest pohlavně dospělých beranů valašské ovce porážených na jatkách nebo na domácích porážkách přímo u vybraných chovatelů plemene. V průběhu porážky byl od beranů odejmut šourek s varlaty, který byl umístěn do vytemperovaného transportního boxu (25 °C). Při této teplotě byly šourky s varlaty během 2–4 hod. od odběru deportovány do laboratoří katedry chovu hospodářských zvířat ČZU v Praze k izolaci epididymálních spermatických buněk a jejich kryokonzervaci.
Po získání suspenze buněk spermií z ocasu nadvarlete byla sledována vstupní kvalita vzorků pomocí vířivého pohybu buněk pod světelným mikroskopem. U všech hodnocených vzorků byl vířivý pohyb větší než 4, a tudíž byly vzorky klasifikovány jako vyhovující a byly dále zpracovávány. Následně byla stanovena koncentrace spermií pomocí předem kalibrovaného spektrofotometru Genesys™ 10vis.Vzorky buněčné suspenze byly dále odstředěny pomocí stolní centrifugy (1000 ot./10 min) a následně byly odpipetovány epididymální spermatické buňky od supernatantu. Po odstředění byl u epididymálních spermatických buněk znovu posouzen vířivý pohyb buněk, aby se potvrdilo, že proces odstředění neměl na spermie negativní vliv. V návazném kroku byly izolované epididymální spermatické buňky ředěny pomocí Dulbeccova PBS na finální koncentraci spermií 2–4 × 109 buněk/ml.
Statististické vyhodnocení bylo provedeno pomocí programu SAS (SAS/STAT® Version 9,3, 2011). Hodnocené ukazatele (celková a progresivní pohyblivost, životaschopnost a mitochondriální aktivita buněk) byly zohledněny statistickým modelem, který obsahoval fixní efekty berana a varianty ředidla či kombinace ředidla. Rozdíly byly vyjádřeny na hladině významnosti P < 0,05.
Podstatou tohoto sledování bylo detekovat kryokonzervační účinek jednotlivých variant ředidel na epididymálních spermatických buněk beranů valašské ovce. Jako základní výchozí ředidla byla použita komerční ředidla AndroMed® a OptiXcell® a kombinace těchto v definovaném poměru. Z detailnější analýzy vlivu ředidla pak vyplývá, že nejvýhodnějšími testovanými variantami pro účel kryokonzervace epididymálních spermatických buněk beranů valašské ovce se ukázaly komerční ředidlo OptiXcell® a jeho směs s ředidlem AndroMed® v definovaném poměru. Obě ředidla dosahovala srovnatelných výsledků, a to jak okamžitě po rozmrazení, tak po dvou hodinách inkubace.
Výsledky indikovaly ředidla vhodná pro kryokonzervaci epididymálních spermatických buněk beranů valašské ovce. Jak samostatné ředidlo OptiXcell® tak směs ředidel OptiXcell® a AndroMed® dosahovaly průkazně vyšších hodnot oproti samostatnému ředidlu AndroMed® ve většině hodnocených ukazatelů. Toto zjištění představuje zásadní optimalizační krok při kryokonzervaci epididymálních spermatických buněk. Dalším důležitým zjištěním je skutečnosti, že izolované epididymální buňky měly lepší toleranci ke kryokonzervaci ve srovnání se spermatickými buňkami získávanými nativním odběrem ejakulátu. To bylo patrné konfrontací výsledků obou zásadních výzkumných etap. Izolace a kryokonzervace epididymálních spermatických buněk z nadvarlat poražených či uhynulých beranů tedy může představovat zajímavý a důležitý nástroj při uchování genetický ohrožených populací.
Celý článek v NCH9/2024.*
Ing. Martin Ptáček, Ph.D., Ing. Filipp Georgijevič Savvulidi, Ph.D., katedra chovu HZ, FAPPZ, ČZU v Praze.
