Technologický postup kryokonzervácie biologického materiálu je široko rozpracovaný a podrobne rieši veľkú škálu vplyvov, ktoré môžu v konečnom dôsledku rozhodovať o stupni životaschopnosti rozmrazeného objektu. Tieto vplyvy zmrazovania boli podrobne študované na bunkách a tkanivách zvierat. Pri zmrazovaní embryí sa na poškodení ich buniek môžu najčastejšie podieľať tri hlavné mechanizmy: mimobunková a vnútrobunková kryštalizácia, vznik koncentrovaných roztokov elektrolýzou a samotný pokles teploty.
Embryá kráv v štádiu moruly a včasnej blastocysty boli presýtené v stúpajúcich koncentráciách glycerínu, a po ekvilibrácii umiestnené v pejetkách a zmrazené programovateľným prístrojom Planer klasickým spôsobom, rýchlosťou 1°C/min do teploty –7°C a po navodení kryštalizácie (seeding) ˗ rýchlosťou 0,3°C/min do teploty –35°C, a následne umiestnené do kontajnera s tekutým dusíkom. Po rozmrazení embryí ponorením pejetiek do vody teplej 27°C na 15 sec boli embryá premývané v klesajúcich koncentráciách glycerolu a umiestnené do media Dulbecco s prídavkami. Kvalita embryí po rozmrazení bola hodnotená svetelným stereomikroskopom a po spracovaní bežným spôsobom pre elektrónmikroskopické analýzy transmisným elektrónovým mikroskopom JEM 100 CX II Jeol pri urýchľovacom napätí 80 kV.
Pre označenie aktinových filamentov cytoskeletu boli blastocysty inkubovane 45 min v roztoku phaloidin-TRITC (Actin Cytoskeleton and Focal Adhesion Staining kit, Chemicon International. CA, USA). Následné boli embryá premyte trikrát v roztoku PBS-PVP, umiestnené na krycie sklíčko a prekryté s montovacím médiom Vectashield s fluorescenčným farbivom DAPI (Vector Laboratories, CA, USA). Krycie sklíčko s embryami bolo potom pripevnené k podložnému sklíčku a pripravené pre fluorescenčnú analýzu pomocou konfokálnej mikroskopie.
Podiel poškodených rozmrazených embryí hodnotených pomocou svetelného mikroskopu predstavoval 14,1 %, zatiaľ čo pomocou elektrónového mikroskopu až 26,6 %.
Predpokladáme, že kryorezistencia raných embryí je spojená s citlivosťou cytoplazmatických membrán buniek trofoblastu a embryoblastu, tiež membrán organel početne zastúpených v obidvoch typoch buniek, ale hlavne tubulárnych, vezikulárnych útvarov a vakuol. Zastúpenie a výskyt týchto útvarov v embryách pri zmrazovaní, ale hlavne rozmrazovaní dáva väčšiu či menšiu šancu na prežitie embryí zmrazovaných a rozmrazovaných rôznymi postupmi.
Jeden z potenciálnych spôsobov, ako zlepšiť prežitie po rozmrazení a úspešnosť po prenose, je upraviť podmienky kultivácie po rozmrazení tak, aby najviac simulovali fyziologický vývoj embrya in vivo.
Na základe nami získaných výsledkov elektrónmikroskopickej a fluorescenčnej analýz zmrazených/rozmrazených embryí kráv sme zistili trvalé poškodenia celistvosti bunkových organel a hlavne ich cytoplazmatických membrán ako aj časté zvýšenie výskytu cytoplazmatických lyzozomálnych štruktúr v bunkách trofoblastu aj embryoblastu. Tieto morfologické zmeny organel sa významne podieľajú na zníženej kvalite embryí a v konečnom dôsledku na nižšej úspešnosti embryotransféru. Minimalizácia následkov týchto poškodení, napríklad použitím niektorých rastových faktorov, by mohla podstatne zvýšiť ich preživateľnosť a vývojovú schopnosť po rozmrazení.
Prof. MVDr. Juraj Pivko, DrSc., Ing. Lucia Olexiková, Ph.D., Ing. Linda Dujíčková, doc. Ing. Jiří Bezdíček, Ph.D., RNDr. Alexander. Makarevič, DrSc., NPPC, Výskumný ústav živočíšnej výroby Nitra, Univerzita Palackého v Olomouci
Podrobněji v časopisu Náš chov 1/2022.
