Laboratorní vyšetření inseminačních dávek býků po jejich rozmrazení

Současným trendem je nalezení spolehlivých prediktorů fertilizační schopnosti inseminačních dávek býků pomocí sofistikovaných laboratorních diagnostických metod, především počítačového systému pro analýzu spermií (CASA) a průtokové cytometrie. V naší studii jsme ověřili použitelnost obou přístupů k predikci fertilizační schopnosti kryokonzervovaných inseminačních dávek holštýnských býků.

Zjistili jsme, že pohyblivost spermií v rozmrazených ID je jedním z nejspolehlivějších prediktorů úspěšnosti zabřezávání. Na základě získaných výsledků a dostupných poznatků k tématu jsme usoudili, že v kombinaci se stanovením některých cytometrických ukazatelů kvality spermií (integrita plazmatické membrány, stav akrozomů a mitochondriální aktivita a stanovení stupně zralosti spermií spolu s vyšetřením stupně fragmentace DNA) může stanovení pohyblivosti poskytnout přesnější informace o fertilizační schopnosti inseminačních dávek býků po jejich rozmrazení.

Metodika

Býci holštýnského plemene (n = 12) byli chováni na vybrané komerční inseminační stanici v optimálních podmínkách s pravidelnou kontrolou reprodukčního zdraví. Věk býků se pohyboval mezi 2 až 6 lety, což odpovídá vrcholu reprodukčních schopností. Na základě výpočtu procenta zabřezávání po všech inseminacích (historické údaje), byli býci rozděleni do dvou kontrastních skupin FertV a FertN. Ejakulát byl získán pomocí umělé pochvy. Ihned po odběru byl makro- a mikroskopicky hodnocen. Ejakuláty, které splňovaly minimální požadavky na kvalitu a objem, byly naředěny komerčním ředidlem. Pomocí automatické plničky byly vyrobeny inseminační dávky (ID) v pejetách. Ty byly následně ekvilibrovány při teplotě 4 °C po dobu dvou hodin. Poté byly dávky zmrazeny v programovatelném mrazicím boxu při optimální mrazicí křivce. Po dokončení mrazicího cyklu byly dávky umístěny do kontejneru s tekutým dusíkem při teplotě – 196 °C. Před laboratorní analýzou byly inseminační dávky rozmrazeny ve vodní lázni (38 °C, po dobu 40 sekund).

Hodnocení ID pomocí systému CASA

Vyhodnocení pohyblivosti spermií bylo provedeno pomocí systému mCASA (model iSperm – pro býky, Aidmics Biotechnology Co., Taipei City, Taiwan). Hodnocena byla celková pohyblivost spermií (CP, %) a progresivní pohyblivost spermií (PP, %).

Hodnocení ID pomocí průtokové cytometrie

Pomocí průtokové cytometrie byla vyhodnocena kvalita spermií v ID: hodnocena byla celistvost plazmatické membrány, stav akrozomu a mitochondriální aktivita. Dále byla stanovena zralost spermií pomocí barvení CMA3. Analýza byla provedena na průtokovém cytometru Novocyte 3000 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) vybaveném softwarem pro analýzu cytometrických dat.

Statistická analýza dat

Pro veškerou analýzu dat a jejich následné vyhodnocení byl použit program SAS/STAT® v9.4. (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

 Závěr

Tato práce vycházela z hypotézy, že zavedení fluorescenčního barviva chromomycinu A3 (CMA3), které spolehlivě indikuje deficit protaminů ve spermiích, a tím jejich nezralost, může v kombinaci s výsledkem CASA analýzy a rutině používaných cytometrických ukazatelů kvality spermatu poskytnout důležité dodatečné informace o oplozovací schopnosti inseminačních dávek. Výsledky naší práce ovšem hypotézu nepotvrdily. Ukázalo se, že klíčovým ukazatelem fertility býků (v kombinaci se stanovením míry poškozeni plazmatické membrány, akrozomální celistvosti, mitochondriální aktivity a zralosti spermatických buněk) je především celková a progresivní pohyblivost spermií: CP a PP byly výrazně vyšší u skupiny býku FERT-V než u skupiny FERT-N. To naznačuje, že pohyblivost spermatických buněk v rozmrazených ID je jedním z nejspolehlivějších prediktorů úspěšnosti zabřezávání. Jako další možný ukazatel kvality spermií se nabízí stanovení úrovně fragmentace DNA, které lze vyhodnotit taktéž pomocí průtokové cytometrie, kdy fragmentaci DNA spermií je možné detekovat pomocí barviva akridinová oranž. Tento potenciální prediktor (v kombinaci s analýzou CASA a barvením CMA3) navrhujeme jako předmět dalšího vědeckého bádání. Výzkum spolehlivých prediktorů fertility ale pokračuje dále nejen v naší laboratoři, ale i ve světově uznávaných výzkumných centrech. Do budoucna tak mohou být vyvinuty ještě zajímavější a využitelnější metody pro hodnocení kvality spermií a tím i oplozovací schopnosti ejakulátu.  

Ing. Filipp Georgijevič Savvulidi, Ph.D., Ing. Veronika Kovářová, Bc. Kristýna Harvánková,  Ing. Martin Ptáček, Ph.D., 

Ing. Jaromír Ducháček, Ph.D., Ing. Nikola Marešová, Katedra chovu hospodářských zvířat, FAPPZ,  ČZU v Praze

Podrobněji v NCH 5/2025.*